粒細(xì)胞集落刺激因子治療急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景；急性肝衰竭是由病毒、藥物、免疫、代謝等多種因素引起的肝細(xì)胞大量壞死而導(dǎo)致的嚴(yán)重的臨床綜合征。在我國引起急性肝衰竭的首要原因是病毒，即臨床所見的重型肝炎。盡管臨床大多數(shù)患者被診斷為慢性重型肝炎，實(shí)際上大部分患者的臨床經(jīng)過都是在慢性肝病基礎(chǔ)上發(fā)生的急性肝衰竭。由于缺乏有效的內(nèi)科治療手段，目前病毒性肝炎所致急性肝衰竭的病死率仍高達(dá)50-80％。肝衰竭能否逆轉(zhuǎn)主要取決于受損肝細(xì)胞的壞死程度和殘余肝細(xì)胞的再生能力，因此從阻斷肝細(xì)胞壞死和促進(jìn)

2、肝細(xì)胞再生這兩方面探討和嘗試新的治療措施有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)廣泛的造血生長因子一粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)具有免疫調(diào)節(jié)的作用，具體表現(xiàn)在G-CSF能夠改變機(jī)體在脂多糖(LPS)刺激后釋放促炎性和抑炎性細(xì)胞因子的平衡。而腸源性內(nèi)毒素血癥在病毒性肝炎急性肝衰竭的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，LPS激活枯否細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，加重肝臟的損傷。推測G-CSF可以通過改變單核巨噬系統(tǒng)在LPS作用下的細(xì)胞因子的

3、釋放平衡阻斷急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展，對急性肝衰竭具有保護(hù)作用。另一方面，隨著干細(xì)胞研究的深入，觀察到骨髓造血干細(xì)胞有增殖分化為肝細(xì)胞的潛能。在肝細(xì)胞大量破壞且增殖受到抑制的情況下，造血干細(xì)胞可遷移入肝臟，參加肝臟結(jié)構(gòu)和功能的重建。G-CSF正是造血干細(xì)胞的有效動(dòng)員劑，因此推測G-CSF可通過動(dòng)員造血干細(xì)胞促進(jìn)肝臟損傷后的肝細(xì)胞再生。 目的；體外觀察G-CSF對慢性重型肝炎(急性肝衰竭)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)功能的調(diào)節(jié)作用

4、，并在此基礎(chǔ)上將G-CSF用于治療D-氨基半乳糖(D-GalN)和LPS聯(lián)合所致的小鼠急性肝衰竭模型，探討其可能的作用機(jī)制，為臨床治療急性肝衰竭提供新的思路。 方法； (1)分別收集慢性重型肝炎患者和健康志愿者的外周靜脈血，分離PBMC，分為空臼對照組，G-CSF預(yù)培養(yǎng)加LPS刺激組和LPS單獨(dú)刺激組。體外培養(yǎng)48小時(shí)后分別用放射免疫法和酶標(biāo)記免疫吸 附測定法檢測各組培養(yǎng)上清中的TNF-α、IL-6、IFN-γ和L-1

5、0水平； 并用RT-PCR法檢測的PBMC中的TNF-α、IL-6、IFN-γ和L-10 mRNA表達(dá)水平。 (2)D-GalN 600mg／Kg聯(lián)合LPS 10gg／kg腹腔注射制造小鼠急 性肝衰竭模型。治療組于造模前24小時(shí)，2小時(shí)和造模同時(shí)分別給 予rhG-CSF 300 gg／kg腹腔注射，對照組相應(yīng)予生理鹽水腹腔注射， 比較兩組小鼠24小時(shí)存活率、血清轉(zhuǎn)氨酶及肝組織病變程度，并用 RT-PCR法檢測肝組織中

6、的TNF-α、IL-6、IFN-γ和L-10 mRNA表 達(dá)水平，采用原位末端標(biāo)記法檢測肝細(xì)胞凋亡。 (3)D-GalN 600mg／Kg聯(lián)合LPS 10gg／kg腹腔注射制造小鼠急 性肝衰竭模型。G-CSF動(dòng)員組于造模前72小時(shí)、48小時(shí)，24小時(shí)‘分別給予rhG-CSF 300 ug／kg腹腔注射，對照組相應(yīng)予生理鹽水腹腔 注射。5-溴脫氧尿核苷(BrdU)標(biāo)記法檢測肝細(xì)胞的增殖指數(shù)；免疫 組化法檢測肝內(nèi)的干細(xì)胞標(biāo)志

7、Thy-1以明確造血干細(xì)胞的遷入情況； 用RT-PCR法檢測肝組織中生長因子HGF、EGF和TGF-αmRNA水 平。 (4)不同濃度的G-CSF與QSG7701細(xì)胞株共培養(yǎng)24小時(shí)、48 小時(shí)和72小時(shí)后用噻唑藍(lán)(MTT)法和BrdU標(biāo)記法檢測QSG7701 的增殖曲線和BrdU標(biāo)記指數(shù)。 結(jié)果； 1．慢性重型肝炎(急性肝衰竭)患者和健康志愿的PBMC在體 外經(jīng)LPS刺激后，培養(yǎng)上清中的TNF-α、I

8、L-6、IFN-γ、IL-10水平均 明顯高于空白對照組，而經(jīng)G-CSF預(yù)培養(yǎng)的PBMC上清中的TNF-α 水平顯著低于LPS單獨(dú)刺激組(2．1lvs3.93，P<0.001；2.56vs5.30， P=0.006)，IFN吖水平亦顯著低于LPS單獨(dú)刺激組(264.74vs410.5 1， P=0.016；520.76vs735.83，P=0.005)。IL-6水平顯著高于LPS單獨(dú)刺激 組(793.99vs620.65，P=

9、0.015；982.35vs733.00，P=0.019)，IL.10水平 亦顯著高于LPS單獨(dú)刺激組(491.52vs355.90．P=0.019； 655.13vs441.85，P=0.012)。PBMC中的TNF.0-α、IL-6、IFN-γ．IL-6 的mRNA水平變化與培養(yǎng)上清相同。 2．D-GalN／LPS所致的小鼠急性肝衰竭，24小時(shí)存活率為20％，組織學(xué)可見大面積肝壞死，血清轉(zhuǎn)氨酶明顯增高，肝細(xì)胞大量凋亡。

10、與對照組相比，治療組小鼠的24小時(shí)存活率顯著提高(68％vs 20％，P=0．004)，肝組織病變程度明顯減輕(p=0．034)，血清中轉(zhuǎn)氨酶水平明顯降低(317．72vs3065．38，P<0．001；302．30vs2983．92，P<0．001)，肝細(xì)胞的凋亡率亦顯著下降(19．26％vs34．06％，P=0．008)。肝組織中TNF-α、IFN-γ mRNA水平顯著低于對照組(0．870vs1．035，P<0．001；0．796

11、vs 1．046．P<0．00 1)，IL-6和IL-10 mRNA水平則顯著高于對照組(1．509vs0．912，P=0．007；0．996vs0．811，P=0．012)。 3．G-CSF預(yù)處理組小鼠肝組織中的肝細(xì)胞增殖指數(shù)顯著增加(24．2％vs16．3％，P=0．008)，但未見明顯Thy-1陽性細(xì)胞。G-CSF預(yù)處理組小鼠肝組織中HGF mRNA的表達(dá)明顯高于對照組(0．804vs0．708，P=0．02)，EGF和T

12、GF-αmRNA的表達(dá)無顯著差異。 4．體外G-CSF與QSG7701細(xì)胞株共培養(yǎng)對其增殖曲線和BrdU標(biāo)記指數(shù)均無明顯影響。 結(jié)論； 1．G-CSF對慢性重型肝炎患者和健康志愿者的PBMC功能均具有調(diào)節(jié)作用，G-CSF預(yù)培養(yǎng)可以抑制PBMC在LPS刺激下TNF-α和IFN-γ的釋放，同時(shí)促進(jìn)IL-6、IL-10的釋放。 2．G-CSF對D-GalN／LPS所致的小鼠急性肝衰竭模型具有保護(hù)作用，可以通過改