粒細(xì)胞集落刺激因子治療慢性缺血性心臟病實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究是通過建立慢性缺血性心臟病動(dòng)物模型，應(yīng)用多種影像學(xué)手段，觀察以不同劑量、不同動(dòng)員時(shí)間窗及不同給藥方式G-CSF治療慢性缺血性心臟病前后心臟整體功能、局部功能和心肌微循環(huán)的變化，探索G-CSF治療的劑量一療效關(guān)系、時(shí)間療效關(guān)系以及最佳的給藥方式等，并從安全性角度進(jìn)行再評價(jià)，探討G-CSF對慢性缺血性心臟病心臟功能影響的可能機(jī)制，從而為臨床實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。 第一部分 慢性缺血性心臟病動(dòng)物模型的建立與評價(jià) 目的：

2、利用開胸植入Ameroid動(dòng)脈收縮環(huán)方法，制備慢性缺血性心臟病小型豬動(dòng)物模型，應(yīng)用多種臨床影像學(xué)方法評價(jià)動(dòng)物模型制備后不同時(shí)間心臟功能的變化，并從病理學(xué)角度觀察心肌及血管組織變化，探討該方法的可靠性和可重復(fù)性。 方法：實(shí)驗(yàn)用小型豬21頭，隨機(jī)分為對照組(n=7)、4周組(n=7)和8周組(n=7)三組。三組動(dòng)物均行開胸手術(shù)游離冠狀動(dòng)脈左回旋支主干，對照組為假手術(shù)組，不置入動(dòng)脈收縮環(huán)。4周組和8周組動(dòng)物均于左回旋支近段放置Amer

3、oid動(dòng)脈收縮環(huán)，制作左回旋支慢性閉塞的模型。按照事先制定的時(shí)間點(diǎn)行電心圖、冠狀動(dòng)脈造影及左室造影檢查、經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查、潘生丁<'99m>Tc-甲氧基異丁基異腈(MIBI)單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層心肌灌注顯像(<'99m>Tc-MIBI-SPECT)及心血池顯像、首過延遲心肌灌注磁共振掃描(CMR)，評價(jià)左室功能、心肌損傷面積及心肌灌注面積的變化。術(shù)后4周(4周組)或8周(8周組)處死動(dòng)物，分離血管和心肌行病理學(xué)檢查。 結(jié)果：2

4、1頭實(shí)驗(yàn)小型豬中仃頭成活，并成功建立慢性心肌缺血模型豬11頭。 應(yīng)用Ameroid動(dòng)脈收縮環(huán)后，4周即可見左回旋支完全或次全閉塞。左室造影結(jié)果顯示，4周時(shí)左室射血分?jǐn)?shù)(LvEF)由術(shù)前73.4±2.3％下降至55.0±9.8％(p<0.001)，LVEF下降絕對值為17.9±6.8％；而到第8周時(shí)，LVEF下降更為顯著，下降了24.4±3.1％：與對照組及4周組相比，8周組LVEF變化絕對值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。心臟

5、超聲檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈收縮環(huán)置入后，4周時(shí)左室舒張末直徑(LVEDd)和左室收縮末直徑(LVESd)即可以明顯增加，回旋支供應(yīng)節(jié)段室壁運(yùn)動(dòng)減弱。SPECT 心肌顯像提示左旋支支配范圍(左心室側(cè)壁或下壁)心肌灌注缺損面積增加(4周：12.8±2.6％；8周：17.5+4.0％)，CMR及病理檢查發(fā)現(xiàn)LCX支配范圍內(nèi)心肌壞死面積增加，伴凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量增加及膠原增生。 結(jié)論：應(yīng)用Ameroid動(dòng)脈收縮環(huán)4周后即可以成功制作慢性缺血性心

6、臟病動(dòng)物模型。 第二部分 粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)對慢性缺血性心臟病動(dòng)物心臟功能及心室重構(gòu)的影響 第一節(jié) 不同劑量G-CSF治療慢性缺血性心臟病的實(shí)驗(yàn)研究 目的：利用已經(jīng)建立的慢性缺血性心臟病動(dòng)物模型，觀察不同劑量G-CSF動(dòng)員對骨髓干細(xì)胞增殖的影響，以及不同劑量G-CSF與心臟功能變化的關(guān)系，探討動(dòng)員劑與干細(xì)胞移植的劑量.療效關(guān)系。 方法：24只豬成功制備慢性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ秃?，隨機(jī)分為4組

7、，分別是對照組(皮下注射等量生理鹽水)、G-CSF低劑量治療組(2.5μg/kg、d，皮下注射，連續(xù)5天)、G-CSF常規(guī)劑量治療組(5μg/kg/d，皮下注射，連續(xù)5天)和G-CSF大劑量治療組(10μg/kg/d，皮下注射，連續(xù)5天)，每組6只。于動(dòng)物模型制備后即刻及G-CSF動(dòng)員后4周行心電圖、冠狀動(dòng)脈造影及左室造影檢查、經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查、<'99m> Tc-甲氧基異丁基異腈 (MIBI) 心肌核素顯像(<'99m>Tc-MIB

8、I-SPECT) 及心血池顯像檢查、<'99m>Tc-甲氧基異丁基異腈 (MIBI)/氟-18 氟化去氧葡萄糖(<'18>F-FDG)心肌雙核素顯像(DISA-SPECT)、首過延遲心肌灌注磁共振掃描(MRI)。比較心臟收縮和舒張功能、心肌損傷面積及心肌灌注面積的變化。G-CSF動(dòng)員后4周處死動(dòng)物，留取心肌及血管組織行病理學(xué)檢查。 結(jié)果：24只入組動(dòng)物存活22只。G-CSF動(dòng)員后，隨G-CSF劑量增加，外61.0±3.5％，明顯

9、高于對照組 (55.6±1.6％，p<0.01)。MRI顯示，G-CSF預(yù)處理后LVEF下降幅度遠(yuǎn)低于對照組 (12.2±3.8％比 18±2.3％，p<0.01)，兩組LVEDV及LVESV均較術(shù)前顯著增加，但是與對照組相比，G-CSF預(yù)處理組術(shù)后4周LVESV低(p<0.05)，而兩組間LVEDV未見明顯差別。G-CSF預(yù)處理還可以減少梗死心肌面積，減少心肌灌注缺損程度。 結(jié)論：預(yù)防性應(yīng)用G-CSF可以延緩慢性缺血性病變進(jìn)展

10、，降低血管狹窄程度。 第三節(jié) 經(jīng)冠脈內(nèi)直接注射粒細(xì)胞集落刺激因子治療慢性缺血性心臟病的安全性和有效性評價(jià) 目的：比較經(jīng)冠脈內(nèi)直接注射與皮下注射G-CSF兩種不同途徑對慢性缺血性心臟病動(dòng)物心臟功能及左室重構(gòu)的影響，并評價(jià)經(jīng)冠脈內(nèi)注射途徑的安全性。 方法：慢性缺血性心臟病動(dòng)物模型制備后4周，存活18只豬。隨機(jī)分為三組：對照組、G-CSF皮下注射組和G-CSF冠脈內(nèi)注射組，每組6只。冠脈內(nèi)注射組經(jīng)冠脈內(nèi)一次性注射足夠

11、劑量的G-CSF(60μg/kg)，皮下注射組動(dòng)物接受G-CSF 5μg/kg/d，連續(xù)5天注射，而對照組不做任何處理。于動(dòng)物模型制備前、術(shù)后4周及術(shù)后8周行行冠狀動(dòng)脈造影及左室造影檢查、<'99m>Tc-甲氧基異丁基異腈(MIBI)心肌核素顯像(<'99m>Tc-MIBI-SPECT)及心血池顯像檢查、鼢<'99m>Tc-甲氧基異丁基異腈(MIBI)/氟-18 氟化去氧葡萄糖(<'18>F-FDG)心肌雙核素顯像(DISA-SPECT

12、)、首過延遲心肌灌注磁共振掃描(MRI)。比較心臟LVEF、心肌損傷面積、心肌灌注面積及存活心肌的變化，并行病理學(xué)檢查。 結(jié)果：與皮下注射不同，冠脈內(nèi)注射G-CSF后，外周血G-CSF峰值時(shí)間在動(dòng)員后5天，而皮下注射后G-CSF峰值出現(xiàn)在動(dòng)員后7天，但是兩組間峰值水平未見顯著差別(554.2±54.1 pg/ml比590.8±87.9 pg/ml，p>0.05)。與皮下注射途徑不同，冠脈內(nèi)注射G-CSF后，豬外周血白細(xì)胞在1天后

13、即開始顯著升高達(dá)到峰值水平，其峰值水平低于皮下注射途徑G-CSF動(dòng)員后豬外周血白細(xì)胞峰值水平。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示，與皮下注射途徑相比，冠脈內(nèi)注射G-CSF后，外周血CD34<'+>細(xì)胞比例與CD34<'+>/CD133<'+>細(xì)胞比例同樣升高，但兩組間未見明顯差別(p>0.05)。與對照組相比，不同動(dòng)員途徑G-CSF治療的兩組動(dòng)物回旋支遠(yuǎn)段血管狹窄程度均降低(P<0.05)，但兩種動(dòng)員途徑未見明顯差別。術(shù)后8周時(shí)，冠脈內(nèi)注射組和皮下注射

14、組動(dòng)物L(fēng)VEF均高于術(shù)后4周時(shí)LVEF(p<0.01)；MRI結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，不同途徑G-CSF治療后LVEF改善幅度均增加(對照組 vs 皮下注射組 vs 冠脈內(nèi)注射組：-2.5±0.8％比5.8±1.2％比5.0±1.0％，p<0.01)，但兩組間未見顯著差別。同時(shí)，不同途徑G-CSF治療均可以改善左室重構(gòu)，增加存活心肌數(shù)量，減少梗死心肌面積，但是兩種途徑間未見顯著差別。 結(jié)論：經(jīng)冠脈內(nèi)注射G-CSF安全，且可以改善

15、慢性缺血性心臟病動(dòng)物心臟功能。 第四節(jié) G-CSF對慢性缺血性心臟病心臟功能影響的機(jī)制研究 目的：本節(jié)通過研究不同劑量G-CSF動(dòng)員后對血管新生、細(xì)胞凋亡及增殖、炎癥免疫及動(dòng)脈粥樣硬化等影響探討不同劑量G-CSF動(dòng)員對心臟功能影響的可能機(jī)制。 方法：24只豬成功制備慢性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ秃螅S機(jī)分為4組，分別是對照組(皮下注射等量生理鹽水)、G-CSF低劑量治療組(2.5μg/kg/d，皮下注射，連續(xù)5天)、G-

16、CSF常規(guī)劑量治療組(5μg/kg/d，皮下注射，連續(xù)5天)和G-CSF大劑量治療組(10μg/kg/d，皮下注射，連續(xù)5天)，每組6只。G-CSF動(dòng)員后4周處死動(dòng)物。雙抗體夾心ELISA法測定血清腫瘤壞死因子-α (TNF-α、血漿腦利鈉肽(BNP)、高敏C-反應(yīng)蛋白(hsCRP)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)及G-CSF濃度，Westem-blot、RT-PCR及免疫組化方法檢測G-CSF對血管新生、細(xì)胞凋亡、增殖以及動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)

17、蛋白及基因的影響。 結(jié)果：常規(guī)劑量和大劑量G-CSF動(dòng)員后，梗死區(qū)域心肌vVVF、VEGF及MCP-1 蛋白及相應(yīng)基因mRNA表達(dá)水平明顯增高，提示局部血管新生和細(xì)胞增殖增加，但是兩劑量間未見明顯差別。與對照組相比，低劑量G-CSF動(dòng)員并不減少梗死邊緣區(qū)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量，而常規(guī)劑量與大劑量G-CSF較其他兩組凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量顯著減少，Westem-blot及RT-PCR結(jié)果顯示G-CSF治療通過抑制心肌梗死后Akt下調(diào)水平減少細(xì)