腎上腺髓質(zhì)素對(duì)大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元的作用及機(jī)制.pdf

1、腎上腺髓質(zhì)素對(duì)大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元的作用及機(jī)制目的腎上腺髓質(zhì)素(ADM)是由52個(gè)氨基酸組成的血管活性多肽，屬于降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)家族，與多種組織的缺血再灌注損傷有關(guān)。有學(xué)者證實(shí)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有ADM的表達(dá)，并與腦缺血再灌注損傷有一定關(guān)系。也有持相反意見(jiàn)的研究報(bào)道。所以我們選用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法、原位雜交組織化學(xué)法、逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)?RT-PCR)分析方法等，驗(yàn)證正常大鼠腦組織是否有ADM及A

2、DMmRNA的表達(dá)及具體表達(dá)的部位；觀察ADM及ADMmRNA在局灶性缺血再灌注大鼠腦組織中的表達(dá)變化規(guī)律；探討ADM對(duì)局灶性缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡、梗死體積及Egr-1mRNA的影響，進(jìn)一步研究ADM在局灶性缺血再灌注腦損傷中的作用. 方法：健康雄性SD大鼠186只，體重200-250g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為正常組(n=12)，假手術(shù)組(n=12)，局灶性腦缺血2h再灌注2h組(n=18)、4h組(n=1

3、8)、22h組(n=54)、46h組(n=18)、70h組(n=18)、118h組(n=18)、166h組(n=18)。其中再灌注22h組又分為：股靜脈注射ADM組(n=12)，頸內(nèi)動(dòng)脈注射ADM組(n=12)，側(cè)腦室注射ADM組(n=12)。采用線栓法制成大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型，阻斷血流2h進(jìn)行再灌注。缺血再灌注各組大鼠在缺血2h再灌注4h時(shí)，參考Bederson等的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分后分別

4、制備石蠟切片和冰凍切片，TTC染色測(cè)定梗死體積，HE染色光鏡下觀察大鼠大腦皮質(zhì)、海馬的組織學(xué)變化，TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡，免疫組織化學(xué)法(SABC法)檢測(cè)ADM陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，原位雜交法檢測(cè)ADMmRNA及Egr-1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)ADMmRNA在大鼠局灶性腦缺血再灌注前后的表達(dá)。原位雜交針對(duì)ADM的多相寡核苷酸探針序列為：5′-TGGGTTCACTCGCTTTCCTAGGCGCGGACA-3′；5′-AGAA

5、GTGGAATAAGTGGGCGCTAAGTCGTG-3′；5′-CGTGTCAAACGCTACCGCCAGAGCATCAAC-3′。針對(duì)Egr-1的多相寡核苷酸探針序列為：5′-GAGGAGATGATGCTGCTGAGCAACGGGGCT-3′；5′-GCCTTTGCCACTCAGTCGGGCTCCCAGGAC-3′；5′-CCTTTTCTCCCAGGACAATTGAAATTTGCT-3′。RT-PCR針對(duì)大鼠ADM前體正義引物為：5

6、′-CCGACAGACAACAGACGC-3′，反義引物為：5′-CACCCTGAGGCAGATGAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物278bp；以β-actin為內(nèi)參照，其正義引物為：5′-GATTGCCTCAGGACATTTCTG-3′，反義引物為5′-GATTGCTCAGGACATTTCTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物690bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物7μl電泳，經(jīng)溴酚藍(lán)染色后用Bio2RADGelDoc2000型影像分析系統(tǒng)檢測(cè)并計(jì)算出各組ADMmRNA電泳條帶與內(nèi)參

7、照β-actin條帶的表達(dá)量像素灰度的比值。 結(jié)果：在正常大鼠大腦內(nèi)有ADM及ADMmRNA的表達(dá)，主要表達(dá)在大腦皮質(zhì)錐體細(xì)胞、海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)、CA4區(qū)錐體細(xì)胞、齒狀回顆粒細(xì)胞層、丘腦的室旁核、視上核、丘腦內(nèi)側(cè)核、丘腦外側(cè)核、韁內(nèi)側(cè)核、室旁組織、脈絡(luò)叢、室管膜細(xì)胞、尾狀核、殼核、蒼白球、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，其中室旁組織為高表達(dá)區(qū)。缺血再灌注各組大鼠在缺血再灌注后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能損傷，其神經(jīng)功能損傷

8、評(píng)分顯著高于假手術(shù)組，p＜0.01。大鼠腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)、海馬ADM及ADMmRNA的表達(dá)明顯高于正常組大鼠，P＜0.01。動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，大腦皮質(zhì)ADM陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在腦缺血2h再灌注22h時(shí)達(dá)高峰，至再灌注166h仍明顯多于正常對(duì)照組，P＜0.01。海馬ADM陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在腦缺血2h再灌注4h時(shí)達(dá)高峰，至再灌注166h仍明顯多于正常對(duì)照組，P＜0.01。大腦皮質(zhì)ADMmRNA在缺血2h再灌注4h達(dá)高峰，再灌注22h已明顯下降，但仍

9、高于正常對(duì)照組及假手術(shù)組ADMmRNA的表達(dá)，P＜0.05，隨缺血再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，ADMmRNA表達(dá)又逐漸升高，至再灌注166h其表達(dá)仍明顯高于于正常對(duì)照組，P＜0.05。注射ADM的各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯低于缺血再灌注組及假手術(shù)組，P＜0.01，尤以頸動(dòng)脈和側(cè)腦室注射ADM兩組更明顯。大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦梗死體積為269±20mm3，股靜脈注射ADM后，腦梗死體積縮小到239±17mm3，減少11.2％，頸動(dòng)脈注射ADM后

10、，腦梗死體積縮小到214±14mm3，減少20.4％，側(cè)腦室注射ADM后，腦梗死體積縮小到209±13mm3，減少22.3％。頸動(dòng)脈注射ADM和側(cè)腦室注射ADM在減少腦梗死體積方面明顯優(yōu)于股靜脈注射ADM，P＜0.05，前二者相比并無(wú)顯著性差異，P＞0.05。缺血再灌注組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于假手術(shù)組，P＜0.01。給予ADM后缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞顯著少于缺血再灌注組

11、，以頸動(dòng)脈注射ADM組和側(cè)腦室注射ADM組更明顯，P＜0.01。假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)有少量Egr-1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，缺血再灌注后缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬Egr-1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)多于假手術(shù)組，P＜0.01，應(yīng)用ADM后三組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬Egr-1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)明顯高于缺血再灌注組，P＜0.01，但以頸動(dòng)脈注射ADM組和側(cè)腦室注射ADM組Egr-1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增高最明顯，P＜0.01。 結(jié)論：ADM及AD

12、MmRNA在大腦皮質(zhì)、海馬、齒狀回、丘腦、室旁組織、脈絡(luò)叢、室管膜細(xì)胞、基底節(jié)、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞有表達(dá)，ADM在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛分布，預(yù)示著ADM在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有重要的作用。大鼠腦缺血再灌注后2h-166hADM及ADMmRNA在大腦皮質(zhì)、海馬呈現(xiàn)規(guī)律性過(guò)表達(dá)，且ADMmRNA的表達(dá)早于ADM蛋白的表達(dá)，可能是神經(jīng)元對(duì)缺血再灌注的保護(hù)性反應(yīng)機(jī)制之一。 股靜脈、側(cè)腦室和頸動(dòng)脈給予外源性ADM能減少神經(jīng)元凋亡、減少梗死