KLF4的泛素化調(diào)節(jié)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究.pdf

1、鋅指轉(zhuǎn)錄因子KLF4主要參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和自我更新在內(nèi)的多種生理過(guò)程，在個(gè)體發(fā)育、應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)外壓力和多種疾病的病理過(guò)程中決定著細(xì)胞的命運(yùn)。因此KLF4的調(diào)控機(jī)制就顯得尤為重要。作為一個(gè)與細(xì)胞周期和分化密切相關(guān)的基因，KLF4在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平都受到精密的調(diào)節(jié)。泛素化修飾是KLF4的翻譯后修飾十分重要的一個(gè)方面，KLF4的蛋白量在細(xì)胞內(nèi)受到泛素-蛋白酶體途徑的嚴(yán)密控制，然而影響KLF4泛素化的機(jī)制目前仍未十分明確。我們的工

2、作即著眼于參與KLF4泛素化調(diào)節(jié)的E3連接酶系統(tǒng)。
　　首先我們購(gòu)買了E3泛素連接酶siRNA文庫(kù)，該文庫(kù)主要包括F-box家族、SOCS-box家族和Cullin家族等約200個(gè)基因的特異性siRNA。利用該文庫(kù)，我們?cè)谌橄侔┘?xì)胞中進(jìn)行了針對(duì)E3泛素連接酶相關(guān)基因的siRNA敲降，以Westernblotting方法篩選敲降后會(huì)影響KLF4蛋白水平的E3連接酶。通過(guò)篩選文庫(kù)我們首先發(fā)現(xiàn)了17個(gè)敲降后導(dǎo)致KLF4蛋白水平上升的基因

3、作為候選E3連接酶，然后我們從cDNA中通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了五個(gè)候選E3連接酶基因，接著我們利用放線菌酮追蹤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FBXO32可以顯著促進(jìn)外源KLF4蛋白的降解。于是我們選擇了FBXO32作為研究對(duì)象進(jìn)行了進(jìn)一步的研究工作，證明了FBXO32可以特異性泛素化KLF4并促進(jìn)KLF4通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解。我們又對(duì)FBXO32泛素化KLF4的具體機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)FBXO32的羧基端能夠與KLF4的氨基端直接結(jié)合，并泛素化修飾KLF

4、4的羧基末端，并且F-box結(jié)構(gòu)域是FBXO32促進(jìn)KLF4泛素化降解的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。此外FBXO32介導(dǎo)的KLF4泛素化降解很有可能依賴于p38通路對(duì)KLF4的磷酸化。
　　隨后，我們對(duì)FBXO32泛素化降解KLF4在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行了初步的研究和探討。KLF4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用自該基因被發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。但由于KLF4在細(xì)胞生命活動(dòng)中的廣泛參與——比如KLF4在抑制增殖的同時(shí)也具有抑制凋亡的特性，又如它

5、在高分化的結(jié)腸隱窩上皮細(xì)胞中表達(dá)，但又具有誘導(dǎo)成年人成纖維細(xì)胞恢復(fù)干性的能力——使得KLF4在腫瘤中的功能因組織、細(xì)胞遺傳背景和外界環(huán)境而異。由于細(xì)胞遺傳背景的異質(zhì)性，KLF4在乳腺癌中的功能更加撲朔迷離，KLF4促進(jìn)或者抑制乳腺癌的能力對(duì)基因表達(dá)背景和壓力刺激的依賴性更大。我們的工作發(fā)現(xiàn)，在正常狀態(tài)下，F(xiàn)BXO32敲降導(dǎo)致的KLF4蛋白積累抑制了永生化乳腺上皮細(xì)胞的遷移能力，但在亞致死劑量DNA損傷的情況下，F(xiàn)BXO32過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的K