Ezrin在乳腺癌發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用研究.pdf

1、乳腺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。本研究分析了Ezrin在乳腺癌組織中的表達(dá)及其意義，并借助反義RNA技術(shù)和化療藥物的作用從不同方面研究了抑制Ezrin表達(dá)對(duì)高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響及可能的作用機(jī)制，同時(shí)本研究還初步探討了RhoA作為上游調(diào)控信號(hào)對(duì)Ezrin表達(dá)的影響，以期明確Ezrin在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，為以Ezrin為靶點(diǎn)的乳腺癌靶向治療提供理論依據(jù)。 本研究論文共分為四個(gè)部分：

2、 1.Ezrin與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系研究 目的：探討Ezrin蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及導(dǎo)管內(nèi)增生性病變中的表達(dá)及其臨床病理意義。 方法: 采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)臨床病理及隨訪資料完整的88例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及54例導(dǎo)管內(nèi)增生性病變組織中Ezrin的表達(dá)情況，分析其與CD44v6、E-Cadherin表達(dá)的關(guān)系及其臨床病理意義，采用Kaplan-Meier法及COX模型分析Ezrin表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性

3、導(dǎo)管癌患者預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果: 1.1Ezrin在不同乳腺導(dǎo)管病變中的表達(dá)情況: Ezrin在乳腺不典型導(dǎo)管增生和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于乳腺普通型導(dǎo)管增生和正常導(dǎo)管上皮組織(P<0.05)，而在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率亦明顯高于不典型導(dǎo)管增生組織(P<0.05)。可見(jiàn)隨著乳腺正常導(dǎo)管上皮從普通型導(dǎo)管增生向不典型導(dǎo)管增生、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)展，Ezrin的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率逐漸上升。 1.2乳腺浸潤(rùn)

4、性導(dǎo)管癌Ezrin表達(dá)與臨床、病理特征的關(guān)系: 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌Ezrin表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例Ezrin強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。Ezrin表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織學(xué)分級(jí)和臨床分期密切相關(guān)，Ezfin強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率隨分化程度的降低和臨床分期的增高而明顯增高(P均<0.05)。 1.3乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌Ezrin表達(dá)的預(yù)后意義: Ezrin強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)組患者在隨訪期內(nèi)各時(shí)點(diǎn)

5、的生存率均明顯低于陰性表達(dá)組(P<0.05)。COX模型多因素分析顯示，Ezrin強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)及淋巴結(jié)狀況、TNM分期均與預(yù)后有相關(guān)性(P<0.05)，可以作為判斷乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。 1.4乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌E-Cadherin、CD44v6表達(dá)與Ezrin表達(dá)的關(guān)系: 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，Ezrin表達(dá)與E-Cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，與CD44v6表達(dá)呈正相關(guān)性(P均<0.05)。 2.

6、反義RNA抑制Ezrin表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 目的：特異性阻斷Ezrin的表達(dá)，觀察其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖和侵襲能力的影響，以期明確Ezrin在乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。 方法: 將anti-pCR3.1-ezrin質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染入高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231。應(yīng)用Western-blot和RT-PCR方法檢測(cè)Ezrin在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)；MTT法檢

7、測(cè)抑制Ezrin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外增殖能力的影響；Boyden小室法檢測(cè)抑制Ezrin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外侵襲能力的影響。 結(jié)果: 2.1反義RNA對(duì)Ezrin蛋白表達(dá)的影響: 轉(zhuǎn)染anti-pCR3.1-ezrin后，MDA-MB-231細(xì)胞中的Ezrin蛋白在24h后明顯降低(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染anti-pCR3.1-ezrin組的Ezrin蛋白表達(dá)為轉(zhuǎn)染pCR3.1空質(zhì)粒組的24.24％，為

8、對(duì)照組的22.22％。 2.2反義RNA對(duì)Ezrin mRNA表達(dá)的影響: 轉(zhuǎn)染anti-pCR3.1-ezrin后，MDA-MB-231細(xì)胞中的Ezrin mRNA在24h后明顯降低(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的Ezrin mRNA無(wú)明顯變化。 2.3反義RNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響: MTT法比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染anti-pCR3.1-ezrin組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和對(duì)照組的OD值分別為0.41±0.0

9、18、0.765±0.058和0.795±0.061。轉(zhuǎn)染anti-pCR3.1-ezrin組細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，抑制率達(dá)47.92％(P＜0.05)。 2.4反義RNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響: Boyden小室法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染anti-pCR3.1-ezrin組細(xì)胞的侵襲能力為對(duì)照組的50.5％±3.2％(P＜0.95)，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的細(xì)胞侵襲能力與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。 3.RhoA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

10、通路參與調(diào)節(jié)Ezrin表達(dá)的作用研究 目的：探討RhoA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)Ezrin表達(dá)的可能作用。 方法: 給予表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)作用不同時(shí)間后，應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)RhoA、RhoA磷酸化形式及Ezrin蛋白的變化情況。給予RhoA激酶特異性抑制劑fasudil預(yù)處理后，應(yīng)用Western-blot方法在RhoA磷酸化和E

11、zrin蛋白的表達(dá)高峰時(shí)間檢測(cè)二者的表達(dá)情況。 結(jié)果: 3.1 EGF對(duì)RhoA的磷酸化和蛋白表達(dá)的影響: Western-blot結(jié)果顯示，給予EGF刺激后，P-RhoA水平逐漸升高，于30 min時(shí)達(dá)高峰；RhoA蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化。 3.2 EGF對(duì)Ezrin蛋白表達(dá)的影響: Western-blot結(jié)果顯示，給予EGF刺激后，Ezrin蛋白水平逐漸升高，于24h時(shí)達(dá)高峰。 3.3 Fasudil

12、對(duì)EGF誘導(dǎo)的RhoA磷酸化及Ezfin蛋白表達(dá)的影響: Westem-blot結(jié)果顯示，用fasudil預(yù)處理MDA-MB-231細(xì)胞后，EGF誘導(dǎo)的RhoA磷酸化水平受到明顯抑制，抑制率為72.73％，同時(shí)Ezrin蛋白的表達(dá)水平亦受到明顯抑制，抑制率為51.28％。 4 小劑量表阿霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞Ezrin表達(dá)和遷移的抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究 目的：探討小劑量法瑪新(進(jìn)口表阿霉素epirubicin，EPI)抑制乳腺

13、癌細(xì)胞遷移的作用機(jī)制。 方法: 觀察小劑量表阿霉素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 Ezrin表達(dá)和細(xì)胞遷移的影響，及Ezrin與E-Cadherin、CD44表達(dá)的關(guān)系。不同劑量的EPI作用于MDA-MB-231細(xì)胞4h后，Western-blot、免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR方法檢測(cè)Ezrin、E-Cadherin和CD44表達(dá)的變化。傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。MTT法檢測(cè)小劑量表阿霉素對(duì)細(xì)胞活力的影響。

14、結(jié)果: 4.1 EPI對(duì)Ezrin、E-Cadherin、CD44蛋白表達(dá)的影響: Western-blot結(jié)果顯示，在不同濃度EPI作用下，Ezrin和CD44的蛋白表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)。2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml作用組中，兩種蛋白的表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。E-Cadherin的蛋白表達(dá)在不同濃度EPI作用下，呈逐漸升高趨勢(shì)。2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml作用組中，E-Cadhe

15、rin的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)得出了相同結(jié)果。 4.2 EPI對(duì)Ezrin、E-Cadherin、CD44 mRNA表達(dá)的影響: RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，各處理組MDA-MB-231細(xì)胞中Ezrin mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比顯著降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)；EPI同樣以劑量依賴性方式抑制CD44 mRNA的表達(dá)，而以劑量依賴性方式促進(jìn)E-Cadherin mRNA的表達(dá)。 4

16、.3 EPI對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響: 傷口愈合實(shí)驗(yàn)顯示，隨著EPI濃度的增加，遷移的細(xì)胞數(shù)逐漸下降。1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml作用組分別下降為對(duì)照組的78.6％、50.0％、35.7％、14.3％。對(duì)照組的傷口幾乎完全愈合。 4.4小劑量EPI對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用: MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EPI不同濃度(1、2.5、5、10μg/ml)作用組的OD值分別為0.92

17、±0.26、0.91±0.35、0.97±0.06、0.89±0.21，與對(duì)照組(0.97±0.40)相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論: 1.Ezrin在乳腺導(dǎo)管癌的癌變中發(fā)揮一定作用。 2.Ezrin可以作為判斷乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌忠者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)，其強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)提示預(yù)后差。 3.Ezrin表達(dá)與E-Cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，與CD44v6表達(dá)呈正相關(guān)性，可能借此參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

18、 4 Ezrin蛋白的表達(dá)與人乳腺癌細(xì)胞的體外侵襲有關(guān)，阻斷Ezrin的表達(dá)，可以有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。 5 RhoA可能作為Ezrin的上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。 6 小劑量表阿霉素能夠以劑量依賴性方式抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移，這一作用不依賴其細(xì)胞毒性。 7小劑量表阿霉素能夠以劑量依賴性方式從基因和蛋白兩個(gè)水平抑制乳腺癌細(xì)胞Ezrin和CD44的表達(dá)，提高E-Cadherin的表達(dá)。