轉錄因子KLF9在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能研究.pdf

1、目的:以前列腺癌細胞LNCaP、PC3、DU145為研究對象，并建立前列腺癌細胞小鼠荷瘤模型，檢測KLF9基因在前列腺癌細胞系中的表達情況及其對前列腺癌細胞生物學效應的影響，并初步探討其影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的可能機制。
　　方法:在研究中，我們用實時熒光定量PCR(RT-PCR)和蛋白質印跡法(WesternBlot)檢測KLF9基因在抗雄藥氟他胺(flutamide)在去雄誘導LNCaP細胞凋亡過程中的變化，以及KLF9在不同前

2、列腺（癌）細胞系中的表達情況。我們構建了攜帶有四環(huán)素可調控(tetracycline-on，Tet-on)基因表達系統(tǒng)的真核表達載體pTRIPZ-KLF9，用慢病毒感染的方法導入人前列腺癌細胞系PC3和DU145中，并在強力霉素(doxycycline，Dox)的誘導下過表達KLF9，分別采用MTT法、克隆形成實驗、FACS法、TUNEL染色及免疫組化(IHC)檢測KLF9過表達對前列腺癌細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響;用構建的pTRI

3、PZ-KLF9和陰性對照質粒轉染的PC3或LNCaP細胞接種于小鼠皮下，觀察轉染了各質粒的PC3或LNCaP細胞在小鼠體內成瘤率、瘤體生長速度以及平均腫瘤體積等方面的變化。并且用Western Blot檢測了凋亡相關蛋白的變化情況以及可能的機制的變化情況，并對涉及機制的可能蛋白做了恢復實驗。
　　結果:在氟他胺抗雄誘導LNCaP細胞發(fā)生凋亡的過程中，可誘導KLF9的表達，且具有隨時間變化的遞增關系;敲除內源性的KLF9基因可以部分

4、降低氟他胺對LNCaP細胞造成的生長抑制。同時發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤細胞(RWPE-1、BPH1)相比，KLF9在前列腺癌細胞系中是低表達的，尤其是在惡性程度更高的雄激素非依賴性細胞系(PC3、DU145、C4-2B)中表達水平更低。過表達KLF9能顯著抑制前列腺癌PC3和DU145細胞的增殖及克隆形成能力(P＜0.001)，并能明顯的誘導細胞凋亡(P＜0.001);且使細胞周期被阻滯在G2/M期。在KLF9過表達抑制細胞增殖并且誘導凋亡的過程

5、中，Western Blot及IHC實驗結果顯示，抗凋亡相關蛋白BCL2、Bcl-xl的表達水平降低(P＜0.01)，凋亡相關蛋白CleavedCasspase3、Cleaved PARP的表達水平明顯升高。在體內實驗中，接種pTRIPZ-KLF9組的小鼠腫瘤成瘤率下降（P＜0.01），小鼠瘤體生長速度明顯慢于對照組(P＜0.001)，實驗終止時，腫瘤平均體積明顯小于對照組(P＜0.001)。在機制方面，KLF9過表達可抑制AKT的活化

6、，同時也抑制AKT下游蛋白mTOR的活化;AKT過表達之后，可以部分恢復由KLF9誘導引起的對前列腺癌細胞PC3、DU145的生長抑制及細胞凋亡。
　　結論:1）轉錄因子KLF9在前列腺癌細胞系中的表達低于其在相應的非腫瘤細胞系中的表達量;2）在抗雄藥物氟他胺誘導LNCaP細胞發(fā)生凋亡的過程中，KLF9基因的表達上調;3）在體外及體內實驗中，KLF9基因過表達后可顯著地誘導前列腺癌細胞發(fā)生凋亡，抑制前列腺癌的生長及體內成瘤;其可能