ELL2在前列腺癌中的功能與泛素化的研究.pdf

1、目的：
　　本課題首先以臨床患者前列腺的病理標(biāo)本為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測人體前列腺癌組織與正常前列腺組織中ELL2表達(dá)差異，觀察隨著前列腺癌的惡性程度增高，ELL2表達(dá)趨勢的改變;繼而以前列腺癌C4-2細(xì)胞為研究對(duì)象，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ELL2-siRNA下調(diào)ELL2基因表達(dá)與Flag-ELL2質(zhì)粒上調(diào)其表達(dá)，利用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)、Transwell小室技術(shù)等觀察對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖能力、凋亡率、侵襲力與遷移的影響;利用W

2、estern-Blot觀察增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡基因caspase-3與PARP、侵襲性與遷移能力相關(guān)因子MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、N-cadherin、E-cadherin和ICAM-1蛋白表達(dá)變化的表達(dá)變化，探討ELL2可能在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制。關(guān)于ELL2泛素化相關(guān)研究:以前列腺癌C4-2細(xì)胞為研究對(duì)象，通過降解時(shí)間對(duì)比與免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)ELL2是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的蛋白。應(yīng)用質(zhì)粒重建與

3、點(diǎn)突變技術(shù)，鑒定ELL2泛素化位點(diǎn)。以293細(xì)胞為研究對(duì)象，把EAF1、EAF2分別與ELL2共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后通過降解時(shí)間對(duì)比與泛素化免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定EAF1與EAF2是否影響ELL2降解。最后，將ELL2與野生型泛素或不同的泛素賴氨酸殘基突變體共同轉(zhuǎn)染，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定參與ELL2泛素化的泛素賴氨酸殘基。本研究探索ELL2在前列腺癌中的作用，為調(diào)控ELL2在細(xì)胞內(nèi)的蛋白濃度，進(jìn)一步研發(fā)治療前列腺癌的靶點(diǎn)與藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方

4、法：
　　1.ELL2在前列腺癌中的表達(dá)及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響
　　1.1、ELL2在前列腺癌中的表達(dá)
　　分別收集臨床前列腺癌組織29例及正常組織22例，免疫組織化學(xué)方法檢測ELL2在這兩種不同組織中的表達(dá)情況。
　　1.2、雄激素作用下對(duì)前列腺癌細(xì)胞ELL2表達(dá)的影響
　　用人工合成雄激素R1881刺激前列腺癌細(xì)胞株LNCaP和C4-2，Western blot和Real-tim

5、e PCR檢測不同濃度及不同作用時(shí)間R1881對(duì)ELL2的影響。
　　1.3、ELL2對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響
　　分別用ELL2-siRNA和Flag-ELL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌C4-2細(xì)胞，應(yīng)用MTT方法檢測細(xì)胞增殖率的變化;應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的變化;Western blot方法檢測增殖細(xì)胞核抗原PCNA及凋亡蛋白Caspase3、PARP的變化;應(yīng)用Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲、遷移能

6、力的改變;Western blot方法檢測MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、ICAM-1、N-cadherin和E-cadherin的表達(dá)變化。
　　2.ELL2泛素化降解關(guān)鍵片段、位點(diǎn)的研究;EAF1/EAF2對(duì)ELL2降解的影響;參與ELL2降解的泛素賴氨酸殘基的研究
　　2.1、ELL2蛋白穩(wěn)定性的檢測
　　用人工雄激素R1881刺激前列腺癌C4-2細(xì)胞表達(dá)ELL2蛋白后，應(yīng)用CHX抑制蛋白合成，Weste

7、rn blot檢測每小時(shí)ELL2蛋白水平，連續(xù)5小時(shí);分別用C4-2細(xì)胞及轉(zhuǎn)染ELL2的293細(xì)胞，檢測蛋白合成抑制劑CHX及蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)內(nèi)源性及外源性ELL2降解的影響。
　　2.2、ELL2泛素化途徑降解及降解片段、位點(diǎn)的檢測
　　Flag-ELL2與HA-Ub質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，MG132抑制蛋白酶體功能，應(yīng)用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，Western blot檢測泛素表達(dá)情況;之后，將不同E

8、LL2片段的Flag載體重組質(zhì)粒（片段1:aal-aa292，片段2:aa293-aa531，片段3:aa532-aa640）轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞，應(yīng)用CHX抑制蛋白合成后，Western blot檢測各片段4h、8h、12h、24h與1h、2h、3h、4h時(shí)間點(diǎn)Flag表達(dá)水平，對(duì)片段3加測15min、30min、45min、60min、75min時(shí)間點(diǎn)Flag表達(dá)水平;最后，將ELL2片段3(aa532-640)所包括的9個(gè)賴氨酸，均制

9、備Flag載體K/R點(diǎn)突變質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞，應(yīng)用CHX抑制蛋白合成，Western blot檢測時(shí)間點(diǎn)0、6h、12h、24h的ELL2蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.ELL2在前列腺癌中的表達(dá)及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響
　　1.1、ELL2在前列腺癌中的表達(dá)降低
　　免疫組化結(jié)果顯示，與正常前列腺組織相比，前列腺癌組織中ELL2表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，且隨著Gleason評(píng)

10、分的增高，ELL2表達(dá)呈逐漸降低的趨勢(P＜0.01)。
　　1.2、ELL2表現(xiàn)為雄激素依賴性
　　Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示，R1881刺激后，LNCaP和C4-2細(xì)胞中ELL2蛋白(P＜0.05)及mRNA(P＜0.05)水平均升高，且在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為劑量、時(shí)間依賴性。
　　1.3、ELL2對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響
　　MTT結(jié)果顯示，前列腺癌C4-2細(xì)

11、胞在轉(zhuǎn)染ELL2-siRNA后，細(xì)胞增殖率上升(P＜0.001) PCNA在蛋白水平上升(P＜0.05)，而在轉(zhuǎn)染Flag-ELL2后，增殖率下降(P＜0.001)，PCNA在蛋白水平下降(P＜0.05);流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ELL2-siRNA組凋亡率下降(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染Flag-ELL2組凋亡率升高(P＜0.01)，Western blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染ELL2-siRNA組Caspase3、PARP蛋白水平下降(P＜0

12、.05; P＜0.01)，而轉(zhuǎn)染Flag-ELL2組Caspase3、PARP蛋白水平升高(P＜0.001;P＜0.001);Transwell結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ELL2-siRNA組細(xì)胞侵襲、遷移能力均增加(P＜0.01，0.05;P＜0.01，P＜0.05)，MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均升高(P＜0.01;P＜0.01;P＜0.01)，N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均升高(P＜0.05;P＜0.05)，E-cadh

13、erin蛋白水平降低(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染Flag-ELL2組細(xì)胞侵襲、遷移能力則下降(P＜0.01;P＜0.01)，MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均下降(P＜0.05;P＜0.01;P＜0.01)，N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均下降(P＜0.01;P＜0.05)，E-cadherin蛋白水平升高(P＜0.001)。
　　2.ELL2泛素化降解關(guān)鍵片段、位點(diǎn)的研究;EAF1/EAF2對(duì)ELL2降解的影響;參與

14、ELL2降解的泛素賴氨酸殘基的研究
　　2.1、ELL2是不穩(wěn)定蛋白
　　Western blot結(jié)果顯示，應(yīng)用CHX抑制蛋白合成后，ELL2蛋白水平逐漸下降，到5小時(shí)降至起點(diǎn)的20％以下;Western blot結(jié)果顯示，無論是內(nèi)源性還是外源性合成的ELL2蛋白，應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132后，ELL2蛋白水平均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05; P＜0.05)。
　　2.2、ELL2經(jīng)泛素化途徑降解;片段3(aa532

15、-aa640)對(duì)于維持其蛋白穩(wěn)定性較重要;K571、K584、K599三個(gè)賴氨酸位點(diǎn)的突變有助于其維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性
　　Flag-ELL2與泛素共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，應(yīng)用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，Western blot結(jié)果顯示，應(yīng)用MG132抑制蛋白酶體后，在ELL2蛋白上方區(qū)域可見到明顯的泛素條帶，而對(duì)照組無泛素條帶;不同片段的ELL2載體轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示，片段3(aa532-

16、aa640)降解速度明顯快于其他兩段，75min時(shí)已經(jīng)大部分降解;片段2(aa293-aa531)最穩(wěn)定，12h時(shí)降解尚不明顯;片段1(aal-aa292)降解速度居中;不同位點(diǎn)的ELL2突變體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示，突變體K/R571、K/R584、K/R599的降解速度明顯較野生型ELL2慢，其他突變體與野生型ELL2相似。
　　結(jié)論：
　　1.ELL2在人體前列腺癌組織中表達(dá)降低，且與腫瘤惡性度

17、相關(guān)。
　　2.ELL2是雄激素反應(yīng)蛋白，其表達(dá)的異常可能與去勢抵抗性前列腺癌的進(jìn)展相關(guān)。
　　3.ELL2蛋白上調(diào)在一定程度上可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，增加其凋亡率，并抑制其侵襲、遷移能力，ELL2參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。
　　4.ELL2蛋白在體內(nèi)經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，其與泛素結(jié)合位點(diǎn)主要在氨基酸片段aa532-aa640中，該片段在維持ELL2的穩(wěn)定性上最為重要，K571、K584、K599三個(gè)賴氨酸是