hARAP5在前列腺癌中的作用及機(jī)制.pdf

1、前言
　　前列腺癌在世界常見惡性腫瘤發(fā)病率中排名第三位，而在男性致死癌癥中名列第六位，常見于歐美等國家，在中國前列腺癌的發(fā)病率較低，但近年來有明顯上升趨勢。前列腺癌的治療方法多以去勢和抗雄激素治療為主，但大多發(fā)展成為去勢抵抗的前列腺癌(CRPC)，難以治愈。目前，大量研究證實(shí)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與雄激素受體(AR)密切相關(guān)。
　　雄激素受體(AR)做為轉(zhuǎn)錄因子屬于類固醇激素受體超家族成員之一，與雄激素配體結(jié)合后被激活而發(fā)揮生物

2、學(xué)作用。AR基本由5個結(jié)構(gòu)域組成，1、氮末端結(jié)構(gòu)域(NTD)2、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)3、鉸鏈區(qū)4、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)5、羧基端結(jié)構(gòu)域(CTD)。
　　AR與配體（如雄激素）結(jié)合后，與熱休克蛋白HSP90解離，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，形成AR二聚體，并結(jié)合到靶基因序列的ARE區(qū)，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　到目前為止，已發(fā)現(xiàn)大量的與AR相互作用的轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)控因子，其中大部分作用在ARAF-2上，如p21介導(dǎo)的激酶PAK6

3、，HBO1，F(xiàn)HL2，Tip60，小窩蛋白1等，p300和SRC-1可與ARAF-1和ARAF-2相互作用，而只有少量輔助調(diào)節(jié)因子僅與ARAF-1相互作用，但這類因子均具有獨(dú)特的功能結(jié)構(gòu)，例如，SRA，BRCA1，ART-21，CDK，ARA24，ARA160，CyclinE等。AR的輔助調(diào)控因子在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，研究其在前列腺癌中的作用機(jī)制具有重要意義。
　　例如，目前已被報(bào)道的AR輔助調(diào)控因子CyclinD1，

4、存在兩個亞基，CyclinD1a和CyclinD1b。CyclinD1a是AR的輔助抑制因子，可以直接結(jié)合并抑制AR，限制細(xì)胞的無限增殖。CyclinD1b的功能剛好與CyclinD1a相反，是AR的輔助激活因子，在前列腺癌中高度表達(dá)，促進(jìn)AR的轉(zhuǎn)錄并參與AR下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，促進(jìn)AR陽性的前列腺癌細(xì)胞的增殖，但對AR陰性的前列腺癌細(xì)胞無任何作用。同時，CyclinD1作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S檢查點(diǎn)，其

5、功能的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在AR依賴的前列腺癌細(xì)胞中，AR通過mTOR誘導(dǎo)CyclinD1的表達(dá)，促進(jìn)CDK4/CyclinD1蛋白復(fù)合物的形成，而CyclinD1亦可對AR進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，CyclinD1的積累通過干擾組蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)的招募從而減弱AR的活性。因此，CyclinD1在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。
　　我們過去利用酵母雙雜交技術(shù)以ARAF-1為誘餌，篩選出AR的一種輔助激活因子，命名

6、為ANT-1（雄激素受體氮末端結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1），即hARAP5。hARAP5可結(jié)合于ARAF-1區(qū)域，增強(qiáng)AR和GR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，但未見對ERa介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起作用。此外，hARAP5也是一種mRNA前體的剪切因子，在剪切體的形成過程中起著重要作用。目前，已有的研究報(bào)道hARAP5含有941個氨基酸，分子量為102kD，含有21個外顯子，定位于染色體22q13.33。hARAP5包含了19個TPR重復(fù)，2個LxxLL基序和

7、1個亮氨酸拉鏈。hARAP5的主要功能結(jié)構(gòu)域?yàn)門PR重復(fù)，TPR重復(fù)調(diào)節(jié)復(fù)合物中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用。但是，關(guān)于hARAP5在前列腺癌中的作用機(jī)制的研究至今未見任何報(bào)道。
　　本課題旨在研究hARAP5作為AR的輔助激活因子在前列腺癌中的作用機(jī)制，為前列腺癌的早期診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新靶點(diǎn)。
　　實(shí)材料與方法
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　1、質(zhì)粒提取試劑盒。
　　2、免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑盒。
　

8、　3、體外轉(zhuǎn)錄試劑盒。
　　4、逆轉(zhuǎn)錄及SYBRPremixExTaq試劑盒。
　　5、PCR擴(kuò)增試劑。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、WesternBlot分析hARAP5在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。
　　2、免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hARAP5在前列腺癌中高度表達(dá)。
　　3、RNA干擾敲除hARAP5。
　　4、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)驗(yàn)證hARAP5結(jié)合與AR的啟動子。
　　5、Real

9、TimePCR研究hARAP5的敲除對AR下游靶基因的影響。
　　6、RealTimePCR分析hARAP5的敲除對CyclinD1的影響。
　　7、用流式細(xì)胞技術(shù)研究hARAP5對細(xì)胞周期的影響。
　　8、克隆實(shí)驗(yàn)和繪制生長曲線驗(yàn)證hARAP5對前列腺癌細(xì)胞增殖的影響。
　　9、Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hARAP5促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移。
　　結(jié)果
　　hARAP5在前列腺癌中高度表達(dá)并促進(jìn)前列腺癌