版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、背景和目的:
前列腺癌是歐美國家男性患者中最常見的惡性腫瘤,影響著美國約1/6男性的健康。近年來隨著人們生活方式的改變、壽命的延長及醫(yī)療保健水平的提高,我國前列腺癌發(fā)病率呈顯著增長趨勢。
早在1941年,芝加哥大學Ben May癌癥研究實驗室研究員Huggins和Hodges證實了前列腺細胞在無雄激素持續(xù)刺激時將會發(fā)生凋亡,開創(chuàng)了腫瘤內分泌治療的先河。前列腺癌內分泌治療的目的是降低體內雄激素水平、抑制睪酮轉化
2、為雙氫睪酮或阻斷雄激素與其受體結合,以抑制或控制前列腺癌細胞生長。隨著對腫瘤病理生理學的進一步認識,前列腺癌內分泌治療已由早期的姑息治療發(fā)展為臨床的主要治療手段之一。雖然多數(shù)前列腺癌患者在首次接受內分泌治療后都有顯著療效,但超過一半的患者最終都會復發(fā)并由激素依賴性前列腺癌(Hormone-Dependent Prostate Cancer,HDPC)進展為激素非依賴型前列腺癌(Hormone-Independent Prostate C
3、ancer,HIPC),表現(xiàn)為前列腺癌細胞的增殖失去調控,PSA進行性升高,極易發(fā)生骨轉移,而且轉變后的治療非常棘手,死亡率極高。
揭示前列腺癌由雄激素依賴向雄激素非依賴性演進的發(fā)生機制,是預防和治療前列腺癌的關鍵。盡管關于前列腺癌生物學行為及其機制的研究有眾多的文獻報道,目前也還沒有一個系統(tǒng)完整的解釋,但很明顯,和大多數(shù)腫瘤一樣,前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多因素多基因多步驟的過程。因此發(fā)現(xiàn)和鑒定引起前列腺癌激素非依賴性
4、演進的關鍵基因及信號分子,并以這些關鍵基因及信號分子為靶點,研究能阻止前列腺癌細胞向雄激素非依賴性轉化的可能機制,有可進一步促進前列腺癌治療技術的發(fā)展。
定位于染色體5p13的Golgi phosphorprotein-3(GOLPH3)基因,是一種磷酸化的高爾基體膜蛋白,參與執(zhí)行高爾基體的蛋白質分選功能。直到2009年6月Nature雜志發(fā)表的Lynda Chin教授的文章首次表明,GOLPH3是第一個被發(fā)現(xiàn)的定位于反面
5、高爾基網(wǎng)的具有強大轉化能力的癌基因。但對GOLPH3基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制的研究剛剛起步。本研究重點在于闡明GOLPH3基因與前列腺癌演進的相關性,并探討其可能的信號網(wǎng)絡途徑。
方法:
1.檢測GOLPH3在全身正常組織(包括前列腺)及其相關病變中的表達
1.1 檢測GOLPH3在全身正常組織及其惡性腫瘤中的表達應用免疫組化EliVision法,檢測28例肺腺癌、胃腺癌、結腸腺癌
6、、肝細胞性肝癌、子宮內膜樣腺癌、乳腺浸潤性導管癌、睪丸精原細胞瘤標本及其配對的正常組織中GOLPH3的表達。
1.2 檢測GOLPH3在前列腺及其相關病變組織中的表達應用免疫組化EliVision法,檢測139例(36.48%) HDPC,102例(26.77%)HIPC,21例HIPC骨轉移灶,61例(16.01%)高級別前列腺上皮內瘤(High-gradeProstatic Intraepithelial Neopla
7、sia,HGPIN),20例(5.25%)良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia,BPH),20例(5.25%)正常前列腺組織中GOLPH3的表達。
2.GOLPH3基因沉默對前列腺細胞生物學特性的影響
2.1 Real-time-PCR檢測GOLPH3基因在4種前列腺癌相關細胞株Du145、PC-3、LNcap和BPH中的表達。
2.2 Western blot
8、及免疫熒光染色檢測GOLPH3及Androgen Receptor(AR)蛋白在4種前列腺癌相關細胞株Du145、PC-3、LNcap和BPH中的表達。
2.3 構建穩(wěn)定沉默內源性GOLPH3的前列腺癌細胞株設計GOLPH3干擾片段,構建含U6啟動子的慢病毒載體,將慢病毒載體質粒與輔助質粒共轉染293FT病毒包裝細胞,收集病毒上清,進行病毒滴度測定,用慢病毒感染DU145細胞,RT-PCR和Western blot鑒定有效
9、的干擾載體。
用含GOLPH3特異性干擾片段的慢病毒感染DU145/EGFP+細胞,用含空載體的病毒做對照。用殺稻瘟菌素篩選抗性克隆,挑取抗性單克隆,熒光定量PCR和Western blot鑒定干擾后GOLPH3基因在細胞中的表達。
2.4 GOLPH3表達沉默對前列腺癌細胞生物學特性的影響流式細胞儀檢測沉默內源性GOLPH3對前列腺癌細胞生長周期及凋亡的影響;MTT法檢測細胞體外生長曲線;平板克隆形成實驗檢
10、測沉默內源性GOLPH3對前列腺癌細胞體外克隆形成能力的影響;軟瓊脂集落形成實驗檢測GOLPH3對前列腺癌細胞錨定非依賴生長能力的影響;Ki-67免疫組化檢測沉默內源性GOLPH3對前列腺癌細胞增殖指數(shù)的影響;三維細胞培養(yǎng)實驗和小室侵襲實驗檢測沉默內源性GOLPH3表達對前列腺癌細胞體外侵襲能力的影響;Transwell小室檢測沉默內源性GOLPH3表達對前列腺癌細胞體外運動遷移能力的影響;平板劃痕愈合實驗檢測沉默內源性GOLPH3表達
11、對前列腺癌細胞體外運動能力的影響。
3.利用基因芯片技術初步探討GOLPH3促進前列腺癌演進的分子機制
3.1 Roche NimbleGen真核生物表達譜芯片檢測GOLPH3基因表達沉默前后差異基因表達譜,并進行差異表達基因的GO功能分析和生物學信號通路分析。
3.2 熒光定量PCR方法驗證芯片差異基因的表達。
3.3 免疫組化檢測差異基因在Du145/GFP+/GOLPH3-和
12、Du145/GFP+/mock細胞以及前列腺癌組織中的表達及其臨床意義。
結果:
1.GOLPH3在正常組織及多種惡性腫瘤中的表達GOLPH3蛋白在全身多器官正常組織中低表達,在部分實體惡性腫瘤組織中,GOLPH3的表達明顯升高,包括胃腺癌、肝細胞性肝癌、乳腺浸潤性導管癌、睪丸精原細胞瘤及子宮內膜樣腺癌等,在結腸腺癌等GOLPH3的表達未見明顯升高。
2.GOLPH3在正常前列腺、前列腺增生、前
13、列腺上皮內瘤變及前列腺癌等組織中的表達在正常前列腺組織及BPH、HGPIN、HDPC、HIPC及其骨轉移灶組織中,GOLPH3均不同程度的表達,正常前列腺及BPH、HGPIN組織中GOLPH3主要呈弱陽性表達,陽性率分別為90%、95%、93.44%,HDPC組織中GOLPH3主要呈弱陽性表達,陽性率為85.61%,正常前列腺、BPH、HGPIN與HDPC間GOLPH3的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.743);在正常前列腺、BPH、HG
14、PIN及HDPC組織中,GOLPH3中到強陽性(++/+++)表達的陽性率分別為5%(1/20)、5%(1/20)、4.92%(3/61)和10.79%(15/139);在HIPC組織中,GOLPH3主要呈中到強陽性(++/+++)表達,陽性率為81.37%(83/102),正常前列腺、BPH、HGPIN、HDPC與HIPC間GOLPH3的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
3.Real-time-PCR檢測GOLP
15、H3基因在4種前列腺癌相關細胞株Du145、PC-3、LNcap和BPH中的表達。
4種前列腺癌相關細胞株中PC-3和Du145是雄激素非依賴性前列腺癌細胞株,其中Du145是高轉移前列腺癌細胞株,PC-3是低轉移前列腺癌細胞株,LNcap是雄激素依賴性前列腺癌細胞株,BPH是良性前列腺增生細胞株。Real-Time PCR結果顯示,前列腺癌相關細胞株PC-3、Du145、LNcap和BPH中GOLPH3在轉錄水平都有不同
16、程度的表達,其中在Du145中表達最高,在PC-3、LNcap和BPH中表達較低。
4.Western blot及免疫熒光染色檢測GOLPH3、AR蛋白在4種前列腺癌相關細胞株中的表達Western blot結果顯示,前列腺癌相關細胞株PC-3、Du145、LNcap和BPH中GOLPH3在蛋白質水平均有不同程度的表達,其中在Du145中表達最高,在PC-3、LNcap和BPH中表達較低;免疫熒光染色結果顯示,GOLPH3
17、在高轉移性的激素非依賴性前列腺癌細胞株DU145中高表達,在低轉移性激素非依賴性前列腺癌細胞株PC-3、激素依賴性前列腺癌細胞株LNcap及良性前列腺增生細胞株BPH中低表達;此外,AR在DU145、PC3及BPH細胞株中均呈低表達,在LNcap細胞株中AR高表達,符合細胞本身屬性。Western blot及免疫熒光染色檢測結果較一致。
5.篩選GOLPH3的有效干擾片段商品化干擾片段siGOLPH3-554、siGOLP
18、H3-728和siGOLPH3-918轉染GOLPH3高表達的高轉移性的激素非依賴性前列腺癌細胞株DU145,Real-time-PCR、Westem blot及RNA Structure軟件分析發(fā)現(xiàn)siGOLPH3-918片段干擾效率最高、最穩(wěn)定。
6.構建穩(wěn)定沉默內源性GOLPH3的前列腺癌細胞株Du145/GFP+/GOLPH3-將siGOLPH3-918干擾片段連接于pGPU6/GFP/Neo siRNA Expr
19、essionVector,構建重組體質粒pGPU6/shGOLPH3-918,經(jīng)包裝細胞293FT包裝的慢病毒感染Du145前列腺癌細胞株,流式細胞儀熒光分選干擾后陽性細胞;Westernblot和細胞免疫組化檢測結果表明穩(wěn)定沉默內源性GOLPH3的前列腺癌細胞株(命名為Du145/GFP+/GOLPH3-)成功建立。
7.流式細胞儀分析細胞周期和凋亡指數(shù)Du145/GFP+/GOLPH3-和對照細胞株Du145/GFP+
20、/mock細胞的S期細胞平均比例分別為28.583±0.743和57.978±0.902,差異有統(tǒng)計學意義(t=19.546,P=0.000); Du145/GFP+/GOLPH3-和Du145/GFP+/mock細胞的凋亡指數(shù)分別為40.583±1.836和17.424±1.258,差異有統(tǒng)計學意義(t=19.546, P=0.000)。MTT法檢測細胞體外增殖能力的影響,與Du145/GFP+/mock細胞相比,Du145/GFP+
21、/GOLPH3-細胞增殖能力降低,差異有統(tǒng)計學意義(F=22.282,P=0.000);平板克隆形成實驗Du145/GFP+/GOLPH3-細胞的活力顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(F=15.359,P=0.017)。軟瓊脂集落形成實驗表明Du145/GFP+/GOLPH3-細胞形成的克隆體積更小、數(shù)目更少,差異具有顯著性(F=174.827,P=0.000)。說明沉默內源性GOLPH3表達后能減弱前列腺癌細胞的錨定非依賴生長能力。
22、 三維細胞培養(yǎng)實驗結果顯示相對于Du145/GFP+/mock細胞,Du145/GFP+/GOLPH3-細胞團較致密,邊緣圓滑或局部皺縮;而對照細胞則表現(xiàn)為細胞團較大,邊緣松散并有偽足向周圍延伸。小室侵襲實驗表明,Du145/GFP+/mock細胞的運動能力是Du145/GFP+/GOLPH3-細胞的2倍,差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.779,P=0.005)。Transwell小室檢測顯示Du145/GFP+/GOLPH3-細胞的
23、侵襲能力降低了2倍,差異具有顯著性(t=4.832,P=0.001)。平板劃痕愈合實驗結果顯示Du145/GFP+/GOLPH3-細胞的運動遷徙能力明顯比Du145/GFP+/mock對照細胞弱。
8.Roche-NimbleGen的高密度全基因組表達譜芯片篩選出了165個與GOLPH3基因協(xié)同作用的基因和259個與GOLPH3基因拮抗作用的基因。其中GOLPH3基因沉默前后,DU-145細胞AR基因的表達沒有明顯的變化;
24、發(fā)現(xiàn)與GOLPH3基因相互作用的基因主要涉及到TGF信號通路、Hedgehog信號通路、MAPK信號通路、P53信號通路等,涉及到的細胞生物學功能主要有細胞運動、細胞粘著、細胞外基質的相互作用、細胞周期調控等,其中與細胞周期調控(TGF-β2、BMP7、CREB5、E2F2、ARRB2、TPK1)、細胞骨架重構(MAP2、CAV1、FLNA)及與細胞外基質相關作用(PLAT、SPP1)的相關基因最為密切。通過熒光定量PCR方法,檢測TG
25、F-β2、BMP7、CREB5、E2F2、ARRB2、TPK1、PLAT、SPP1、MAP2、CAV1及FLNA基因在Du145/GFP+/GOLPH3-和DU145/EGFP+/mock細胞中的表達情況,結果顯示熒光定量PCR結果與芯片的結果是一致的,驗證芯片結果的可靠性。免疫組化結果顯示,與Du145/GFP+/mock相比較,Du145/GFP+/GOLPH3-細胞中TGF-β2、BMP7、E2F2、ARRB2、SPP1、MAP2
26、、CAV1及FLNA蛋白的表達降低,CREB5核PLAT蛋白的表達升高。139例HDPC中,TGF-β2、BMP7、CREB5、E2F2、ARRB2、PLAT、SPP1、MAP2、CAV1及FLNA蛋白中到強陽性表達率分別為15.11%、36.69%、58.27%、12.95%、40.29%、63.31%、42.45%、31.65%、27.34%和35.25%,102例HIPC中,TGF-β2、BMP7、CREB5、E2F2、ARRB2
27、、PLAT、SPP1、MAP2、CAV1及FLNA蛋白中到強陽性表達率分別為85.29%、55.88%、21.57%、62.75%、57.84%、40.20%、61.76%、75.49%、57.84%和56.86%。與在HDPC組織中的表達相比較,TGF-β2、BMP7、E2F2、ARRB2、SPP1、MAP2、CAV1及FLNA蛋白在HIPC組織中到強度表達的陽性率表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義,P值分別為0.000、0.005、0.
28、000、0.010、0.005、0.000、0.000和0.001,x2值分別為117.182、8.762、64.983、7.267、12.634、8.784、45.219、22.764和11.130;與在HDPC組織中的表達相比較,CREB5和PLAT蛋白在HIPC組織中到強度表達的陽性率表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義,P值分別為0.000和0.001,x2值分別為32.386和12.634;免疫組化結果進一步驗證并支持芯片檢測結果。
29、
結論:
1.癌基因GOLPH3可能不是前列腺癌發(fā)生的早期分子事件,但癌基因GOLPH3與前列腺癌的演進高度相關。
2.癌基因GOLPH3是前列腺癌細胞增殖、運動、侵襲和轉移等功能的促進基因。
3.癌基因GOLPH3可能通過TGF-β信號通路、Hedgehog信號通路,通過TGF-β2、BMP7、CREB5、E2F2、ARRB2、PLAT、SPP1、MAP2、CAV1及FLNA等功
30、能相關基因,調控前列腺癌細胞與細胞外基質的相互作用,重構腫瘤周圍基質微環(huán)境,從而促進激素依賴性前列腺癌的演進。
本研究的創(chuàng)新之處
(1) GOLPH3是新確定的癌基因,本項目在國際上首次發(fā)現(xiàn)并證明癌基因GOLPH3與前列腺癌的演進密切相關,是前列腺癌細胞增殖、運動和侵襲、轉移等功能促進基因。
(2)雄激素是前列腺最主要的細胞增殖刺激物和細胞凋亡抑制物,傳統(tǒng)觀點認為,前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與AR依賴性
31、的信號通路密不可分。本研究結果表明GOLPH3可通過與AR無關的信號通路調控前列腺癌細胞的生長,促進前列腺癌的演進。這一研究結果進一步豐富了前列腺癌與AR無關的旁路激活途經(jīng)的理論。
(3) TGN的主要功能是參與蛋白質的分類、包裝及運輸,保證蛋白質的單向轉運,以往認為定位于TGN的蛋白質與癌癥發(fā)病沒有直接相關。本研究表明定位于TGN的蛋白質GOLPH3具有促進前列腺癌演進的功能,為腫瘤的表觀遺傳學研究提供新的視角,對揭示腫
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 新型高爾基蛋白在前列腺癌中的表達及GOLPH3促進前列腺癌轉移的機制研究.pdf
- MAZ基因在前列腺癌中的功能及其作用機制的研究.pdf
- lncrnarp13650j16.1在前列腺癌中的功能及其作用機制研究
- 長鏈非編碼RNa-PCA3在前列腺癌中的功能及分子機制的初步研究.pdf
- CircRNA--CDR1as在前列腺癌細胞系中的功能及作用機制研究.pdf
- RACK1蛋白在前列腺癌中的功能研究.pdf
- 前列腺癌患者血清microRNA表達特點及miR-21在前列腺癌細胞中的功能研究.pdf
- hARAP5在前列腺癌中的作用及機制.pdf
- PTEN在前列腺癌中的表達及其抑癌機制研究.pdf
- FilaminA在前列腺癌進展中的實驗研究.pdf
- Pim-1在前列腺癌中作用機制的初步研究.pdf
- ATF3在前列腺癌中的表達及意義.pdf
- CD133在前列腺-前列腺增生-前列腺癌中的表達.pdf
- 磁共振在前列腺癌診斷中的應用
- PARP-1在前列腺癌中表達的意義及其在前列腺癌PC3細胞株增殖中的作用研究.pdf
- Galectin-3在前列腺癌中的表達及意義.pdf
- Hepcidin和鐵代謝在前列腺癌進展中的作用機制研究.pdf
- DWI在前列腺癌診斷中的應用價值.pdf
- ELL2在前列腺癌中的功能與泛素化的研究.pdf
- PCA3 mRNA在前列腺癌診斷中的應用價值研究.pdf
評論
0/150
提交評論