長(zhǎng)鏈非編碼RNa-PCA3在前列腺癌中的功能及分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分、pGLV3/H1-shRNA干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株及pCDH-GFP-PCA3過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選與驗(yàn)證
　　目的:PCA3基因在前列腺癌中高度特異性的表達(dá)，預(yù)示著PCA3對(duì)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。目前，PCA3在前列腺癌中的功能及機(jī)制尚不清楚。為了探究其功能，我們通過(guò)構(gòu)建PCA3的干擾及過(guò)表達(dá)載體，并篩選出相應(yīng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，為后續(xù)的體外功能研究提供依據(jù)。
　　方法:從Genbank中查找PCA3基因的序列號(hào)及其對(duì)應(yīng)序列，使

2、用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)PCA3分子的shRNA，分別構(gòu)建4對(duì)pGLV3/H1-sh2456，pGLV3/H1-sh2618，pGLV3/H1-sh2702及pGLV3/H1-sh2913干擾載體及pGLV3/H1-control對(duì)照，以下調(diào)其在LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)。將構(gòu)建好的干擾載體包裝成病毒后感染LNCaP細(xì)胞，經(jīng)realtime PCR驗(yàn)證后篩選出干擾效率較高的細(xì)胞株;從PCA3高表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP中提取總

3、RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)三對(duì)引物，以cDNA為模板擴(kuò)增3個(gè)分片段，通過(guò)重疊延伸后連接成全長(zhǎng)構(gòu)成PCA3。將PCA3與pCDH-GFP質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑選克隆后并經(jīng)PCR、酶切進(jìn)行驗(yàn)證，送測(cè)序。將構(gòu)建好的pCDH-GFP-PCA3表達(dá)質(zhì)粒包裝成病毒后感染前列腺癌細(xì)胞株DU145及PC3，流式分選并經(jīng)real time PCR驗(yàn)證后獲得分別過(guò)表達(dá)PCA3及含空載的穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　結(jié)果:

4、測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了干擾載體，而且real time PCR結(jié)果同時(shí)證實(shí)并建立了穩(wěn)定低表達(dá)PCA3的前列腺癌細(xì)胞株及穩(wěn)定高表達(dá)PCA3的前列腺癌細(xì)胞株。
　　結(jié)論:PCA3干擾及過(guò)表達(dá)載體的成功構(gòu)建，為深入研究PCA3基因在前列腺細(xì)胞中的作用奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為探索前列腺癌治療的新途徑提供了可能。
　　第二部分、研究PCA3干擾和過(guò)表達(dá)后對(duì)前列腺癌細(xì)胞功能的影響及機(jī)制的初步研究
　　目的:研究PCA3干擾和過(guò)表達(dá)后在體

5、外對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖、周期、遷移及侵襲的影響。
　　方法:將第一部分篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通過(guò)CCK-8法(PCA3過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn))和EdU法（PCA3干擾實(shí)驗(yàn)）及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖能力，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移及侵襲能力。并將存在功能差異的干擾細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，探求兩組細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平分子的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:下調(diào)PCA3的表達(dá)后，LNCaP細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的增殖能力下降

6、(P＜0.05)，且遷移（P=0.0001）與侵襲（P＜0.0001）能力也顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在DU145及PC3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PCA3后，細(xì)胞在增殖、遷移及侵襲的生物學(xué)功能方面與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PCA3分子后，實(shí)驗(yàn)組中與細(xì)胞粘附信號(hào)通路的基因表達(dá)有明顯的下降，而參與TGF-beta信號(hào)通路的基因表達(dá)明顯上升。
　　結(jié)論:PCA3可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，下調(diào)PCA3后能顯著抑制