長鏈非編碼RNAlinc00844在前列腺癌中作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　前列腺癌是西方國家男性最常見的惡性腫瘤之一，是引起美國男性死亡的第二大癌癥。我國男性前列腺癌發(fā)病率要低于西方國家，但隨著人口老齡化和生活條件的改善，我國男性的前列腺癌發(fā)病率也越來越高，呈明顯上升趨勢。前列腺癌發(fā)病機制的研究一直是腫瘤研究的熱點問題。前列腺癌是一種雄激素依賴的惡性腫瘤。目前認為，雄激素在前列腺癌的生長、轉(zhuǎn)移和分化中起重要作用。雄激素受體信號通路的研究也極大地提高了我們對前列腺癌發(fā)生的認識，從而導(dǎo)致了雄

2、激素剝奪療法在前列腺癌治療中的成功發(fā)展。然而，經(jīng)過一段時間雄激素剝奪治療后，前列腺癌患者病情通常會進入停滯期，對于治療變得不敏感，繼而轉(zhuǎn)變成雄激素非依賴型的前列腺癌，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)移和死亡。因此，雄激素受體信號通路的機制并不能完全解釋前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，這表明還存在其他導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生發(fā)展的過渡和替代機制。
　　自從雄激素剝奪療法發(fā)展以來，前列腺癌的藥物研究進入了一個瓶頸期。研究表明，除了雄激素受體信號通路外，PI3K/Akt等信

3、號通路同樣也參與前列腺癌的形成，但從這些研究結(jié)果中并未發(fā)現(xiàn)有效的治療藥物。隨著上世紀80年代早期催化性RNA的發(fā)現(xiàn)，研究者們意識到，RNAs不只是一個介于DNA和蛋白質(zhì)之間的中間產(chǎn)物，而是一個動態(tài)的、多功能的分子，它調(diào)節(jié)各種細胞過程的功能，包括癌癥發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)最終導(dǎo)致了基于RNA的療法的出現(xiàn)，這大大拓寬了藥物開發(fā)的范圍。
　　目前我們對前列腺癌發(fā)生發(fā)展的認識主要是基于對蛋白質(zhì)編碼基因的研究，針對非編碼基因在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中作用

4、的研究還有很大的認識空間。長鏈非編碼RNAs(IncRNAs)是一類長度韶過200個堿基長度的非編碼RNA，本身不編碼蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。IncRNAs由基因組DNA通過轉(zhuǎn)錄剪接而成?；蚪M編碼大量的IncRNAs，但是關(guān)于它們在生物體內(nèi)的功能卻知之甚少。近年來，越來越多的研究表明，IncRNAs參與多種細胞活動，包括胚胎發(fā)育、細胞生長、分化以及代謝等生理過程。此外，研究發(fā)現(xiàn)，多種IncRNA在前列腺癌患者體內(nèi)發(fā)生異常表達，表明IncRNA可

5、能參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，起到了促癌或抑癌的作用。例如，IncRNA PCA3(prostate cancer antigen3)在良性和惡性前列腺癌患者的尿液中都能檢測到PCA3。通過尿液檢測發(fā)現(xiàn)，大約95％的前列腺癌患者的PCA3表達都有顯著升高。此外，PCAT-1(prostate cancer-associated ncRNA transcript1)在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中高表達且具有高度的癌組織特異性。PCGEM1(pros

6、tate cancer gene expression marker1)在前列腺癌中表達升高并且能促進細胞增殖和腫瘤群落形成。越來越多的研究表明，IncRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著十分重要的作用。
　　為進一步闡明與前列腺癌有關(guān)的IncRNA調(diào)控機制，尋找潛在的有效前列腺癌臨床診斷標記物和治療靶點，我們通過IncRNA高通量測序的方法對前列腺癌組織進行了測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA linc00844在前列腺癌組織中

7、的表達水平顯著降低。然而，linc00844與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及其潛在的調(diào)控機制仍不清楚。為了闡明linc00844與前列腺癌的關(guān)系以及其潛在的生物學(xué)功能，我們通過前列腺癌臨床標本檢測和分子細胞生物學(xué)功能實驗對linc00844與前列腺癌之間的相關(guān)性進行了系統(tǒng)的研究分析。
　　研究目的：
　　前列腺癌發(fā)病機制以及臨床診斷和治療的研究是腫瘤研究的熱點問題。前期我們發(fā)現(xiàn)IncRNA linc00844在前列腺癌組織中表達

8、水平顯著降低，提示linc00844與前列腺癌有關(guān)，但具體相關(guān)性和調(diào)控機制不明。在本研究的目的在于闡明linc00844與前列腺癌的臨床相關(guān)性及其生物學(xué)功能和表達調(diào)控機制，為尋找更為有效的前列腺癌臨床診斷、預(yù)后分析標記物和治療靶點，以及前列腺癌藥物的開發(fā)提供新的理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.實時熒光定量PCR分析比較前列腺癌組織和細胞中l(wèi)inc00844mRNA的表達情況;
　　2.通過TCGA和Taylor前列

9、腺癌患者數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析以及基因簇富集分析方法分析linc00844表達水平與前列腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;
　　3.分子克隆方法構(gòu)建linc00844過表達載體，轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞，通過transwell實驗觀察linc00844對前列腺癌細胞侵襲和遷移的影響;
　　4.利用TCGA前列腺癌患者數(shù)據(jù)庫進行生存曲線分析，觀察linc00844表達水平與前列腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性;
　　5.雄激素刺激體外培養(yǎng)的前列腺癌細

10、胞，實時熒光定量PCR檢測雄激素信號通路是否對linc00844轉(zhuǎn)錄表達具有調(diào)控作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.linc00844在前列腺癌腫瘤組織中表達情況:實時熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，前列腺癌組織中l(wèi)inc00844的表達顯著降低。進一步地，利用TCGA和Taylor數(shù)據(jù)庫中的高通量測序結(jié)果進行分析比較，發(fā)現(xiàn)linc00844在正常前列腺組織中高表達，而隨著前列腺癌的發(fā)生與遠處轉(zhuǎn)移，其表達量顯著降低，提示

11、linc00844可能在前列腺癌的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的抑癌作用。
　　2.linc00844表達水平與前列腺癌患者的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系:以前列腺癌Gleason評分為標準，將前列腺癌臨床標本分為兩組:Gleason＜7和Gleason≤7組。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，Gleason＜7組樣本中l(wèi)inc00844的表達水平要明顯低于Gleason≤7組的樣本。此外，通過利用TCGA和Taylor數(shù)據(jù)庫中的高通量測序結(jié)果分析比

12、較，同樣也顯示Gleason評分越高的PCA組織中，linc00844的表達水平也越低，提示linc00844可能發(fā)揮了抑癌作用。
　　3.linc00844表達水平與前列腺癌形成發(fā)展的臨床相關(guān)性:通過對3個獨立的高通量測序研究產(chǎn)生的6個數(shù)據(jù)集進行基因簇富集分析(GSEA)，發(fā)現(xiàn)那些在前列腺癌、前列腺轉(zhuǎn)移癌以及TMPRSS2-ERG陽性前列腺癌中低表達的基因在linc00844高表達組患者的前列腺癌中都富集表達。相反，那些在上述3

13、種癌組織中高表達的基因在linc00844低表達組前列腺癌患者中富集表達。該大數(shù)據(jù)分析結(jié)果與我們之前的臨床病理分析結(jié)果一致，均提示linc00844在前列腺癌種可能發(fā)揮了重要的抑癌作用。
　　4.linc00844對前列腺癌細胞侵襲遷移的影響:在linc00844低表達的前列腺癌細胞系PC3和DU145中高表達linc00844，細胞transwell實驗結(jié)果顯示，linc00844過表達明顯降低了PC3和DU145細胞的的侵襲遷

14、移能力。
　　5.linc00844表達水平與前列腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析:利用TCGA前列腺癌患者數(shù)據(jù)庫進行生存曲線分析，發(fā)現(xiàn)linc00844高表達的前列腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存率和總生存率均顯著高于linc00844低表達的患者，提示linc00844具有作為前列腺癌的預(yù)后分子標記物的潛質(zhì)。
　　6.雄激素信號通路對linc00844表達的調(diào)控:通過分析VCaP細胞的雄激素受體染色質(zhì)免疫共沉淀測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)雙氫睪酮作用后

15、，雄激素受體與linc00844基因的結(jié)合明顯增強，而雄激素受體抑制劑比卡魯胺、JQ1和MDV3100則能抑制雄激素受體與linc00844的結(jié)合。進一步地，在體外培養(yǎng)的VCaP細胞中加入雙氫睪酮，分別作用4h、12h和24h，實時熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙氫睪酮顯著增強linc00844的轉(zhuǎn)錄表達，而雄激素受體抑制劑MDV3100則能阻斷雙氫睪酮引起的linc00844表達升高。以上結(jié)果提示，linc00844的表達受雄激素受體信號通