長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肺腺癌分子診斷-預(yù)后中的應(yīng)用及功能研究.pdf

1、研究目的和意義：
　　自20世紀(jì)80年代起，肺癌已經(jīng)逐步成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率及致死率最高的癌癥之一，而且發(fā)病率和致死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，跟據(jù)2016年美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)的調(diào)查統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌在男性和女性患者中的平均致死率分別為27％和26%，位居惡性腫瘤致死率之首。在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率和病死率逐年上升，已經(jīng)成為對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。近年來，隨著肺癌突變基因研究的不斷深入和大量靶向藥物的研究應(yīng)用，肺癌的治療逐步向以基因?yàn)?/p>

2、導(dǎo)向的個(gè)體化治療轉(zhuǎn)變。在過去，人們將肺癌個(gè)體化治療研究的重點(diǎn)放在編碼基因上，而隨著研究的不斷深入人們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non coding RNA，lncRNA）在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著不可忽視的重要作用，同時(shí)其顯著的腫瘤組織特異性及其應(yīng)用于腫瘤診斷的可能性也使其日益成為腫瘤研究中新的熱點(diǎn)。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的研究者采用高通量基因組篩選技術(shù)，根據(jù)基因功能來鑒別新型肺癌。試圖在對(duì)肺癌進(jìn)行有效分型的基礎(chǔ)上開發(fā)

3、更精確的診斷工具，從而對(duì)肺癌進(jìn)行更好的治療。本研究的目的是通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）對(duì)不同亞型肺癌組織進(jìn)行全基因組lncRNA差異表達(dá)分析，以發(fā)現(xiàn)在肺腺癌組織中存在異常表達(dá)并且與肺腺癌病人預(yù)后密切相關(guān)的lncRNA，并且探討肺腺癌特異性lncRNA在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　研究方法：
　　（1）通過RNA-Seq技術(shù)檢測(cè)肺癌相關(guān)的基因；（2）發(fā)現(xiàn)和識(shí)別潛在的肺腺癌lncRNA分子診斷標(biāo)志物；（3）發(fā)現(xiàn)和識(shí)別肺

4、腺癌潛在的lncRNA預(yù)后生存標(biāo)志物；（4）用qRT-PCR的方法驗(yàn)證肺腺癌異常表達(dá)的linc00857在獨(dú)立肺腺癌組織及癌旁正常肺組織樣品集中（樣品集合包括101例肺癌組織，19例正常肺組織）的表達(dá)；（5）通過COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析和Kaplan-Meier曲線進(jìn)行生存分析（總生存率的計(jì)算以手術(shù)治療后五年生存期為限），明確linc00857在獨(dú)立樣本庫(kù)中對(duì)肺腺癌病人生存的影響，進(jìn)而分析linc00857與臨床肺腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病

5、理特征的相關(guān)性；（6）選取linc00857高表達(dá)肺腺癌細(xì)胞系，分離提取胞漿和胞核RNA，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)linc00857在胞漿和胞核中的分布情況；（7）采用WST-1實(shí)驗(yàn)，小室侵襲、轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)linc00857進(jìn)行功能性研究；（8）采用SCID小鼠人肺腺癌細(xì)胞皮下移植瘤模型研究linc00857在體內(nèi)對(duì)肺腺癌細(xì)胞的作用；（9）通過流式細(xì)胞術(shù)明確linc00857對(duì)肺腺癌細(xì)胞周期的影響；（10）通

6、過Affymetrix ST2.1 exon microarray基因芯片研究linc00857和其他基因之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)linc00857潛在的調(diào)控通路；（11）通過RT-PCR、Westernblot方法驗(yàn)證蛋白和RNA改變。
　　研究結(jié)果：
　　一、通過RNA-Seq技術(shù)檢測(cè)肺腺癌特異性lncRNA及驗(yàn)證
　　1.通過RNA-Seq技術(shù)檢測(cè)肺癌相關(guān)的基因：采用Illumina Hi-Seq2000對(duì)145例肺癌相

7、關(guān)樣品進(jìn)行測(cè)序和生物學(xué)分析后，一共篩選得到21560個(gè)基因，包括16017個(gè)蛋白編碼基因（占74%），1726個(gè)假基因（占8%）和3136個(gè)lncRNA（占15%）
　　2.發(fā)現(xiàn)和識(shí)別潛在的肺腺癌lncRNA分子診斷標(biāo)志物：將我們的RNA-Seq結(jié)果與另外兩個(gè)已發(fā)表的獨(dú)立RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行綜合分析，共篩選出281個(gè)肺腺癌特異性表達(dá)的lncRNA。
　　3.發(fā)現(xiàn)和識(shí)別肺腺癌潛在的lncRNA預(yù)后生存標(biāo)志物：對(duì)281個(gè)肺腺

8、癌特異性表達(dá)的lncRNA分別進(jìn)行生存分析，一共發(fā)現(xiàn)有127個(gè)與生存密切相關(guān)的lncRNA。之后在已發(fā)表的Okayama肺腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)（Okayma M. Cancer Res.,2011，Affymetrix U133 plus2.0 array方法測(cè)得，包括226例一期和二期肺腺癌組織）對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)127個(gè)lncRNA中有54個(gè)在Okayama數(shù)據(jù)庫(kù)中也與肺腺癌病人生存相關(guān)，其中34個(gè)的p值小于0.01。
　　4.綜合

9、評(píng)定各項(xiàng)指標(biāo)，選取肺腺癌中異常高表達(dá)并且與肺腺癌病人不良預(yù)后密切相關(guān)的linc00857作為研究對(duì)象。
　　5. qRT-PCR驗(yàn)證：發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中l(wèi)inc00857基因異常高表達(dá)，與RNA-Seq結(jié)果顯著相關(guān)，（p<0.05），同時(shí)生存分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的linc00857與肺腺癌病人不良預(yù)后密切相關(guān)（p<0.05）。
　　二、 lncRNA linc00857在肺腺癌細(xì)胞中的功能性研究
　　1.WST-1實(shí)驗(yàn)表明敲低

10、linc00857之后，肺腺癌H1299和H838細(xì)胞的增殖能力被顯著抑制（p<0.01）；
　　2.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明linc00857表達(dá)下調(diào)之后可顯著抑制H1299和H838細(xì)胞克隆形成能力（p<0.01）；
　　3. Transwell侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)表明linc00857表達(dá)下調(diào)之后H1299和H838侵襲和轉(zhuǎn)移能力被顯著性抑制；
　　4.通過裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比linc00857敲低的H1299

11、細(xì)胞皮下成瘤能力顯著性降低。
　　三、肺腺癌特異性lncRNA linc00857的初步機(jī)制研究
　　1.分別檢測(cè)linc00857在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)linc00857在肺腺癌細(xì)胞系H1299和H838細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有分布，而且linc00857在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)要高于其在細(xì)胞核中的表達(dá)。
　　2.采用Affymetrix ST2.1 exon microarray芯片研究linc00857能夠調(diào)控的肺腺

12、癌相關(guān)基因及其所在的信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)linc00857敲低表達(dá)后H1299和H838細(xì)胞中共有136個(gè)基因的表達(dá)被下調(diào)，共有116個(gè)基因的表達(dá)都被上調(diào)。
　　3.通過對(duì)Affymetrix SNP6.0芯片的結(jié)果和RNA芯片結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，Linc00857對(duì)它基因組臨近的基因ANXA11和MAT1A并無顯著性影響，提示Linc00857并不是通過調(diào)節(jié)其基因組臨近基因起到作用。
　　4.對(duì)在Okayama數(shù)據(jù)庫(kù)和UM RNA-

13、Seq數(shù)據(jù)庫(kù)中與linc00857正相關(guān)的基因進(jìn)行了DAVID Gene Ontology分析發(fā)現(xiàn)，大部分與linc00857正相關(guān)的基因都與細(xì)胞周期進(jìn)程顯著性相關(guān)。
　　5.通過流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)干擾linc00857表達(dá)之后周期相關(guān)蛋白CDK2和CCNE1的表達(dá)降低。這表明linc00857能夠通過調(diào)節(jié)周期相關(guān)蛋白從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而影響肺腺癌細(xì)胞的增殖。
　　研究結(jié)論及意義：
　　

14、1.通過RNA-Seq和生物信息學(xué)技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)肺腺癌中存在異常表達(dá)并且與肺腺癌病人預(yù)后顯著相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA集合。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)長(zhǎng)鏈非編碼RNA linc00857在肺腺癌組織中特異性高表達(dá)，并且與肺腺癌病人的不良預(yù)后密切相關(guān)。
　　3.通過功能學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低長(zhǎng)鏈非編碼RNA linc00857表達(dá)后，可顯著抑制肺腺癌細(xì)胞H838和H1299體外增殖、遷移、侵襲、克隆形成能力，抑制H1299在小鼠體內(nèi)的增殖