CCDC170-C6ORF97的亞細胞定位及其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　基因CCDC170/C6ORF97（簡寫為CCDC170）位于6號染色體長臂6q25.1區(qū)域，與雌激素受體α(ESR1)臨近，是ESRl上游的開放讀碼框。近來，已證明CCDC170/C6ORF97-ESR1基因座是參與遺傳性及散發(fā)性乳腺癌進展的理想候選基因，CCDC170/C6ORF97與乳腺癌易感性有明確的相關(guān)性。近來的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)提示，CCDC170/C6ORF97-ESR1基因座(6q2

2、5.1)上的12個變異與乳腺癌和骨質(zhì)疏松癥的風險相關(guān)。研究者識別了位于CCDC170/C6ORF97-ESR1基因間區(qū)域的乳腺癌風險相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP) rs2046210。許多相關(guān)研究已開始探討不同人群中這個GWAS基因座與乳腺癌風險的關(guān)系。人們發(fā)現(xiàn)，相對于雌激素受體陽性乳腺腫瘤，rs2046210在雌激素受體陰性乳腺腫瘤中有更強的風險相關(guān)性，提示這個風險變異很可能不依賴于ESR1。
　　相關(guān)研究已報道了散發(fā)性乳腺癌及

3、其他癌癥中的CCDC170無義突變(如pE48和pQ405)。近來有研究報道，通過高通量的轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了從ESR1第二個非編碼外顯子到 CCDC170第六個和/或第七個外顯子的腫瘤特異性基因重排。進一步研究表明，氨基末端(N末端)截短的CCDC170蛋白(p.593-715)是由這個ESR1-CCDC170基因座重排所致。這個截短蛋白的表達增加了乳腺癌細胞的運動性并增強了正常肌上皮細胞的轉(zhuǎn)化。大量的研究表明，CCDC170蛋白的各種

4、變異在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。因此，很有必要對這個未知基因的特征及功能進行深入研究。但至今為止，全長CCDC170蛋白及其突變蛋白的亞細胞定位、在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能尚未見報道。
　　本研究擬首次研究全長CCDC170蛋白及其突變蛋白的亞細胞定位，并探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機制。
　　第一部分 CCDC170及其突變蛋白的亞細胞定位研究
　　目的
　　觀察全長CCDC170蛋白及其突變蛋白在腫

5、瘤細胞內(nèi)的亞細胞定位，并探討其細胞內(nèi)定位的可能機制。
　　材料與方法
　　1.應(yīng)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建攜帶GFP、CCDC170基因及其截短突變體的重組質(zhì)粒： Tight質(zhì)粒（TRE-Tight-GFP、TRE-Tight-GFP-CCDC170、TRE-Tight-GFP-Q405、TRE-Tight-GFP-E48、TRE-Tight-GFP-p.593-715）、非Tight質(zhì)粒（pCMV6-GFP-p.593-715）

6、。用于后續(xù)實驗研究。
　　2應(yīng)用定點誘變技術(shù)，構(gòu)建攜帶CCDC170基因第1810位及第2047位核苷酸點突變的重組質(zhì)粒：Tight質(zhì)粒和非Tight質(zhì)粒。用于后續(xù)實驗研究。
　　3.將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7-tet-on細胞，以western blotting方法檢測全長CCDC170蛋白及截短CCDC170蛋白的表達，驗證質(zhì)粒構(gòu)建準確無誤。
　　4.將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7-tet-on細胞及Hela細胞，以GFP

7、抗體、RCAS1抗體行免疫熒光實驗，熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡下拍照，觀察全長CCDC170蛋白及截短CCDC170蛋白在MCF7-tet-on細胞及Hela細胞內(nèi)的亞細胞定位。
　　結(jié)果
　　1. CCDC170基因重組質(zhì)粒的蛋白表達驗證的結(jié)果顯示，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7-tet-on細胞，以GFP抗體、CCDC170抗體行western blotting分析，可見“GFP-CCDC170”融合蛋白或“GFP-截短CC

8、DC170”融合蛋白的準確表達。
　　2. CCDC170在 MCF7-tet-on細胞內(nèi)定位的研究結(jié)果顯示，全長 CCDC170蛋白定位于高爾基體，其1810位核苷酸及2047位核苷酸點突變的突變蛋白亦定位于高爾基體，與全長 CCDC170蛋白無明顯差別。其截短突變蛋白 pQ405則定位于細胞漿。
　　3. CCDC170及其截短CCDC170蛋白在Hela細胞內(nèi)定位的研究結(jié)果顯示，全長CCDC170蛋白定位于高爾基體，“

9、GFP-截短CCDC170”融合蛋白的亞細胞定位是：GFP-pQ649定位于細胞核周邊，GFP-pQ405、GFP-pV264定位于細胞漿，GFP-pE48、GFP-p.593-715定位于全細胞。截短CCDC170蛋白可導(dǎo)致野生型CCDC170失去正常的亞細胞定位。
　　4. CCDC170通過羧基末端(C末端)附著于高爾基體表面，在CCDC170的C末端，有2個序列(以區(qū)域a和b表示)可能對CCDC170的高爾基體定位有重要作

10、用。直接的C末端（區(qū)域b）是特定的高爾基體附著所必需的，但這對高爾基體的定位尚不足夠，通過直接C末端(區(qū)域 b)的附著可能需要第二序列(區(qū)域 a)。
　　第二部分 CCDC170在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機制
　　目的
　　觀察CCDC170對乳腺癌細胞增殖、移動能力的影響，觀察CCDC170與相關(guān)腫瘤分子標記物的表達、微管蛋白乙酰化的關(guān)系，檢測CCDC170在乳腺癌細胞的基礎(chǔ)表達及其對細胞增殖能力的影響，探討CC

11、DC170在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機制。
　　材料與方法
　　1．以攜帶野生型CCDC170及其截短基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-tet-on細胞，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，檢測GFP陽性的MCF7-tet-on細胞中Ki-67陽性細胞的比例。
　　2．以攜帶野生型 CCDC170及其截短基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 MCF7-tet-on細胞，通過軟瓊脂細胞集落形成實驗，觀察細胞集落形成數(shù)目，檢測轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒的MCF7-tet-on細胞的增

12、殖、移動能力。
　　3.以攜帶野生型CCDC170及其截短基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7-tet-on細胞，應(yīng)用Western blotting技術(shù)，觀察CCDC170與p53、裂解PARP-1、EGFR、Gab1、pSTAT3、AKT、pAKT等腫瘤分子標記物表達的關(guān)系。
　　4.以CCDC170 SiRNA轉(zhuǎn)染MCF7-tet-on細胞，行CCDC170基因敲低，并以CCDC170基因敲低的MCF7-tet-on細胞行細胞劃痕實

13、驗，觀察CCDC170在乳腺癌細胞中的基礎(chǔ)表達及其對細胞增殖的影響。
　　5.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，觀察野生型CCDC170及其截短蛋白對腫瘤細胞微管蛋白乙?；挠绊憽?br>　　結(jié)果
　　1.免疫熒光結(jié)果顯示，在 GFP陽性表達的MCF-7-tet-on細胞中，pCMV6-GFP、pCMV6-GFP-CCDC170、pCMV6-GFP-Q405三組中Ki-67陽性細胞的百分比分別為67％、44%、48%。pCMV6-GFP-C

14、CDC170及pCMV6-GFP-Q405組的Ki-67陽性細胞百分比明顯低于 pCMV6-GFP組（P＜0.05），pCMV6-GFP-CCDC170與pCMV6-GFP-Q405組相比則無明顯差異（P＞0.05）。
　　2.免疫熒光結(jié)果顯示，在GFP高表達的MCF-7-tet-on細胞中，pCMV6-GFP、pCMV6-GFP-CCDC170、pCMV6-GFP-p.593-715三組中Ki-67陽性細胞的百分比分別為57%、

15、32%、71%，pCMV6-GFP-CCDC170組的Ki-67陽性細胞百分比明顯低于pCMV6-GFP組（P＜0.001），pCMV6-GFP-p.593-715組的Ki-67陽性細胞百分比明顯高于pCMV6-GFP組（P＜0.05）。而在GFP低表達的MCF-7-tet-on細胞中，pCMV6-GFP-CCDC170組的Ki-67陽性細胞百分比明顯低于pCMV6-GFP組（P＜0.05），pCMV6-GFP-p.593-715組的K

16、i-67陽性細胞百分比與pCMV6-GFP組相比無明顯差異（P＞0.05）。
　　3.軟瓊膠細胞集落形成實驗結(jié)果顯示，pCMV6-GFP-CCDC170、pCMV6-GFP-Q405組形成的細胞集落數(shù)目少于pCMV6-GFP組，而pCMV6-GFP-p.593-715組形成的細胞集落數(shù)目多于pCMV6-GFP組，pCMV6-GFP-CCDC170與pCMV6-GFP-Q405組形成的細胞集落數(shù)目相仿。
　　4.Western

17、 blotting結(jié)果顯示，pCMV6-GFP-CCDC170組裂解PARP-1的表達強度高于 pCMV6-GFP-p.593-715組及 pCMV6-GFP組（對照）；至于 p53、EGFR、Gab1、pSTAT3、AKT、pAKT的表達強度，pCMV6-GFP-CCDC170組與pCMV6-GFP-p.593-715組及pCMV6-GFP組相比，無明顯差異。
　　5. CCDC170敲低及細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，隨著細胞劃痕愈合

18、時間的推移，對照siRNA組的細胞缺損區(qū)域明顯減小，siRNA A、siRNA C組的細胞缺損區(qū)域亦有所減小，但減少程度較弱。24、48、72、96小時對照siRNA組的細胞劃痕愈合率分別為17.80%、34.68%、48.71%、61.35%，siRNA A組為7.23%、16.98%、26.37%、38.90%，siRNA C組為14.25%、24.25%、31.61%、43.21%，siRNA A、siRNA C組的細胞劃痕愈合速

19、度明顯慢于對照siRNA組。
　　6.免疫熒光結(jié)果顯示，pCMV6-GFP、pCMV6-GFP-CCDC170、pCMV6-GFP-Q405、pCMV6-GFP-p.593-715轉(zhuǎn)染的hela細胞中均有強度不等的乙?；⒐艿鞍妆磉_（紅色熒光）。計算紅色熒光的校正總細胞熒光（CTCF），可見 pCMV6-GFP-CCDC170組的CTCF值最高，pCMV6-GFP-Q405組次之，pCMV6-GFP組及pCMV6-GFP-p.59

20、3-715組最低。pCMV6-GFP-CCDC170組、pCMV6-GFP-Q405組的CTCF值顯著大于 pCMV6-GFP組（P＜0.05），而pCMV6-GFP-p.593-715組的CTCF值與 pCMV6-GFP組相比無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論
　　1.野生型CCDC170蛋白定位于腫瘤細胞的高爾基體，是定位于高爾基體的卷曲螺旋蛋白家族成員。截短CCDC170蛋白可導(dǎo)致野生型CCDC170失去正常的亞細

21、胞定位。
　　2. CCDC170通過C末端附著到高爾基體表面，在CCDC170的C末端，有兩個特定序列可能對CCDC170在高爾基體的定位有影響。
　　3.在調(diào)節(jié)乳腺癌細胞增殖、細胞運動性及細胞侵襲時，野生型 CCDC170與截短CCDC170蛋白具有不同的作用。過表達的野生型CCDC170顯著地抑制細胞的增殖及細胞移動、侵襲，pQ405亦抑制細胞的增殖，而p.593-715則促進細胞的增殖。
　　4.野生型CCDC

22、170及截短CCDC170蛋白在細胞內(nèi)定位、功能上均存在差異，提示 CCDC170的亞細胞定位和致瘤潛能之間有相關(guān)性，即通過基因突變，CCDC170蛋白在高爾基體正常定位的破壞可導(dǎo)致乳腺癌細胞增殖、侵襲能力的變化，進而影響乳腺癌病情的進展。
　　5.基礎(chǔ)表達的野生型 CCDC170促進乳腺癌細胞的增殖,過表達的野生型CCDC170則顯著地抑制乳腺癌細胞的增殖。過表達的野生型 CCDC170可能通過調(diào)節(jié)PARP-1的裂解促進乳腺癌細

23、胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞增殖；亦可能通過促進微管蛋白乙酰化而抑制細胞增殖。野生型CCDC170及截短CCDC170蛋白對乳腺癌細胞增殖的不同影響可能與微管蛋白乙酰化有關(guān)。
　　6.本研究首次闡述了新的乳腺癌相關(guān)蛋白CCDC170的亞細胞定位及功能，揭示了CCDC170在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及作用機制。填補了該研究領(lǐng)域的空白。以CCDC170相關(guān)通路異常作為研究目標，可能是乳腺癌治療的新策略，將揭示乳腺癌靶向治療的新途徑，有望改