鋅指蛋白307在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的初步功能研究.pdf

1、研究目的：
　　本課題的研究目的:探討ZNF307在肝癌的發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色，為肝癌的診斷、治療提供新的理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1、熒光定量PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞株和組織標(biāo)本中ZNF307的表達(dá)
　　在正常人肝細(xì)胞株LO2和肝癌細(xì)胞株MHCC97L，HCCLM3，Huh7，QGY7701，QGY7703，Bel7402，Bel74042中提取細(xì)胞mRNA，熒光定量PCR檢測(cè)ZNF307的表達(dá)水平。提取33

2、例肝癌及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本的mRNA，熒光定量PCR檢測(cè)組織標(biāo)本中ZNF307的表達(dá)水平。
　　2、Western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞株和組織中ZNF307的表達(dá)
　　在正常人肝細(xì)胞株LO2和肝癌細(xì)胞株MHCC97L，HCCLM3，Huh7，QGY7701，QGY7703，Bel7402，Bel74042中提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)上述8株細(xì)胞中ZNF307的表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)4對(duì)肝癌及

3、癌旁組織標(biāo)本中ZNF307的表達(dá)水平。
　　3、構(gòu)建ZNF307敲低細(xì)胞株并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率
　　利用購買自上海吉瑪公司的含有ZNF307基因干擾片段的shRNA，采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染相對(duì)高表達(dá)ZNF307的肝癌細(xì)胞，用含空載體的病毒做對(duì)照。熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)ZNF307干擾效率。
　　4、構(gòu)建ZNF307過表達(dá)細(xì)胞株并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率
　　利用購買自上海吉瑪生物公司的含有ZNF307基因片段的L

4、entivirus病毒載體轉(zhuǎn)染相對(duì)低表達(dá)ZNF307基因的肝癌細(xì)胞，用含空載體的病毒做對(duì)照。熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)ZNF307過表達(dá)效率。
　　5、ZNF307基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　利用平板克隆、CCK-8、劃痕實(shí)驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)、流式凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZNF307基因沉默后對(duì)肝癌細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響。
　　6、ZNF307基因過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　

5、　利用平板克隆、CCK-8、劃痕實(shí)驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)、流式凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZNF307基因過表達(dá)后對(duì)肝癌細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響。
　　7、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZNF307基因沉默和過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響
　　應(yīng)用上述構(gòu)建的穩(wěn)定干擾肝癌細(xì)胞株MHCC97L和穩(wěn)定過表達(dá)肝癌細(xì)胞株Bel7402，與對(duì)照組細(xì)胞分別在裸鼠左右腋下行皮下注射，每5天對(duì)裸鼠皮下瘤進(jìn)行測(cè)量及數(shù)據(jù)分析，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)揭示ZNF307基因沉默和過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)

6、胞增殖能力的影響。
　　8、Western blot檢測(cè)ZNF307基因沉默和過表達(dá)的肝癌細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化
　　Western blot檢測(cè)ZNF307基因穩(wěn)定沉默和過表達(dá)的肝癌細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白（Caspase3、BAX和BCL-2）的表達(dá)情況，探討ZNF307基因影響肝癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。
　　研究結(jié)果：
　　1、ZNF307在肝癌細(xì)胞株中mRNA及蛋白水平表達(dá)下調(diào)
　　用Western

7、blot檢測(cè)MHCC97L, HCCLM3, Huh7, QGY7701, QGY7703,Bel7402，Bel74042共7株人肝癌細(xì)胞和1株人正常肝細(xì)胞L02 ZNF307蛋白的內(nèi)源性表達(dá)，結(jié)果顯示ZNF307蛋白在正常肝癌細(xì)胞株LO2中表達(dá)明顯高于MHCC97L，HCCLM3，Huh7，Bel7402細(xì)胞（由高到低），與QGY7701，QGY7703和Bel7404細(xì)胞無明顯差異，提示ZNF307蛋白在肝癌細(xì)胞中普遍低表達(dá)。We

8、stern blot檢測(cè)ZNF307蛋白表達(dá)水平與熒光定量PCR檢測(cè)的RNA表達(dá)水平趨勢(shì)基本一致。
　　2、ZNF307在肝癌組織中mRNA及蛋白水平表達(dá)下調(diào)
　　利用熒光定量PCR檢測(cè)33對(duì)肝細(xì)胞癌組織及癌旁正常肝組織ZNF307的mRNA水平表達(dá)。結(jié)果顯示ZNF307在肝癌組織中表達(dá)低于癌旁正常肝組織(Z=-4.404，P＜0.001)，ZNF307在肝細(xì)胞癌組織轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。
　　利用Western blot檢測(cè)

9、4對(duì)肝細(xì)胞癌組織及癌旁正常肝組織ZNF307的蛋白水平表達(dá)。結(jié)果顯示ZNF307在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常肝組織，ZNF307在肝細(xì)胞癌組織蛋白翻譯水平下調(diào)。
　　3、ZNF307基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　(1)構(gòu)建ZNF307敲低細(xì)胞株并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率:應(yīng)用含有ZNF307干擾片段的shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源性表達(dá)ZNF307較高的肝癌細(xì)胞MHCC97L和QGY7701。熒光定量PCR和Western bl

10、ot分別證實(shí)干擾組較對(duì)照組ZNF307表達(dá)降低，有顯著差異(MHCC97L:t=69.640，P＜0.001; QGY7701:t=43.725，P＜0.001)。
　　(2)ZNF307干擾后促進(jìn)肝癌細(xì)胞株體外增殖能力:CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，干擾ZNF307細(xì)胞體外增殖能力(MHCC97L:F=62.066，P＜0.001;QGY7701:F=10.525，P＜0.001)和克隆能力增強(qiáng)(MHCC97L

11、:t=7.252, P＜0.05; QGY7701: t=10.713, P＜0.001)。
　　(3)ZNF307干擾后促進(jìn)肝癌細(xì)胞株體外侵襲能力:Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，干擾ZNF307細(xì)胞體外侵襲能力增強(qiáng)(MHCC97L: t=13.976, P＜0.001; QGY7701: t=25.652, P＜0.001)。
　　(4)ZNF307干擾后促進(jìn)肝癌細(xì)胞株體外遷移能力:劃痕實(shí)

12、驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，干擾ZNF307細(xì)胞體外遷移能力增強(qiáng)(MHCC97L: t=22.979, P＜0.001; QGY7701: t=19.489, P＜0.001)。
　　(5)ZNF307干擾后抑制肝癌細(xì)胞株凋亡:流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，干擾ZNF307細(xì)胞凋亡率明顯降低(MHCC97L:t=8.414，P＜0.05; QGY7701:t=47.369，P＜0.001)，提示

13、ZNF307沉默抑制肝癌細(xì)胞凋亡。
　　4、ZNF307基因過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　(1)構(gòu)建ZNF307過表達(dá)細(xì)胞株并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率:應(yīng)用含有ZNF307-cDNA的慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源性表達(dá)ZNF307較低的肝癌細(xì)胞Bel7402和HCCLM3。熒光定量PCR和Western blot分別證實(shí)過表達(dá)組較對(duì)照組ZNF307表達(dá)升高，有顯著差異(Bel7402: t=105.364，P＜0.001; HCCLM3:

14、t=126.165，P＜0.001)。
　　(2)ZNF307過表達(dá)后抑制肝癌細(xì)胞株體外增殖能力:CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，過表達(dá)ZNF307細(xì)胞體外增殖能力(Bel7402:F=27.136，P＜0.001;HCCLM3:F=4.541，P＜0.05)和克隆能力降低(Bel7402:t=16.670, P＜0.001; HCCLM3: t=10.169, P＜0.05)。
　　(3)ZNF307過表達(dá)

15、后抑制肝癌細(xì)胞株體外侵襲能力:Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，過表達(dá)ZNF307細(xì)胞體外侵襲能力降低(Bel7402: t=8.358, P＜0.05; HCCLM3: t=24.607, P＜0.001)。
　　(4)ZNF307過表達(dá)后抑制肝癌細(xì)胞株體外遷移能力:劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，過表達(dá)ZNF307細(xì)胞體外遷移能力降低(Bel7402: t=19.176, P＜0

16、.001;HCCLM3: t=6.031, P＜0.05)。
　　(5)ZNF307過表達(dá)后促進(jìn)肝癌細(xì)胞株凋亡:流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，過表達(dá)ZNF307細(xì)胞凋亡率明顯升高(Bel7402:t=7.790，P＜0.05; HCCLM3:t=17.451，P＜0.001)，提示ZNF307過表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。
　　5、ZNF307基因沉默和過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響
　　裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

17、表明，與對(duì)照組相比，ZNF307干擾后皮下成瘤的增殖能力增強(qiáng)(F=31.378，P＜0.05)。相反，ZNF307過表達(dá)后皮下成瘤的增殖能力降低(F=33.629，P＜0.05)。
　　6、ZNF307基因沉默和過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　Western blot檢測(cè)MHCC97L干擾ZNF307和Bel7402過表達(dá)ZNF307后凋亡相關(guān)蛋白（Caspase3、 BAX和BCL-2）的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)沉默Z

18、NF307后Caspase3和BAX表達(dá)降低，BCL-2表達(dá)升高。相反，過表達(dá)ZNF307后Caspase3和BAX表達(dá)升高，BCL-2表達(dá)降低，提示ZNF307基因可能通過調(diào)控凋亡通路相關(guān)蛋白從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。
　　研究結(jié)論：
　　1、ZNF307基因/蛋白在人肝癌細(xì)胞/組織中的表達(dá)明顯降低。
　　2、ZNF307基因抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖、侵襲、遷移及促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。
　　3、ZNF307基因可能通過調(diào)