RAI16和SNORD113-1在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第六位，死亡率居腫瘤相關(guān)死亡的第三位（WHO GLOBOCAN項(xiàng)目2012年數(shù)據(jù)），其中肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌的80％～90％。隨著科技的進(jìn)步，HCC早期診斷與治療取得了巨大的進(jìn)展，但是患者5年生存率也只有17％～53％，復(fù)發(fā)率高達(dá)70％。尋找HCC早期診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)是領(lǐng)域內(nèi)

2、研究的重要熱點(diǎn)之一。
　　目前已知的HCC標(biāo)志分子可分為組織標(biāo)志物與血清標(biāo)志物兩大類，組織標(biāo)志物主要包括GPC3、HSP70、TAG72、Ki-67、HepPar1、HERC5等。血清標(biāo)志物主要有AFP、AFP-L3、GP73、APO-J、DKK-1、HCR2、Midkine、脫-γ-羧基凝血酶原、GPC3、α-1-巖藻糖苷酶、HGF、NGF、VEGF、TGF-β、EGFR、Wnt、促血管生成素-1/2、NOTCH等。目前只有血清

3、標(biāo)志物AFP應(yīng)用于HCC臨床輔助診斷，并且約1/3 HCC患者血清AFP陰性。
　　因此，進(jìn)一步鑒定參與HCC發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志分子，不僅有助于理解HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，還有助于發(fā)現(xiàn)具有HCC早期診斷和生物治療潛在的新靶標(biāo)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)多個HCC相關(guān)新分子，本文選擇在HCC中差異表達(dá)的RAI16和SNORD113-1進(jìn)行深入研究，以闡明它們在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。
　　一、RAI16對HCC發(fā)生發(fā)展促進(jìn)作用的

4、機(jī)制研究
　　RAI16（Retinoic acid-induced protein16，維甲酸誘導(dǎo)蛋白16，又稱FAM160B2）屬于維甲酸誘導(dǎo)蛋白質(zhì)(Retinoic acid-induced protein，RAI)家族，大小82kDa。RAI在人、大鼠、小鼠、兔子和斑馬魚中高度保守，可調(diào)節(jié)多種疾病的發(fā)生發(fā)展。RAI16是一個相對較新的蛋白，其結(jié)構(gòu)與功能鮮有報道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，RAI16可作為miR-483-5p的靶標(biāo)

5、分子，可促進(jìn)HCC腫瘤的發(fā)生，可作為HCC基因治療的潛在靶標(biāo)和HCC診斷的分子標(biāo)志物，過表達(dá)還具有抗凋亡作用，但其促進(jìn)HCC發(fā)生和抗凋亡作用的機(jī)制并不清楚。本文旨在探討RAI16促進(jìn)HCC發(fā)生和介導(dǎo)抗凋亡的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1、利用蛋白質(zhì)組學(xué)（免疫共沉淀、串聯(lián)質(zhì)譜分析）分析與RAI16相互作用的蛋白。
　　2、分別構(gòu)建不同長度的RAI16、PKA-RⅡα、HSP70、14-3-3θ表達(dá)質(zhì)粒，利用mappi

6、ng study以及免疫共沉淀技術(shù)檢測RAI16與PKA-RⅡα、HSP70、14-3-3θ之間直接作用的序列位置。
　　3、體外純化RAI16、PKA-RⅡα蛋白，利用ELISA實(shí)驗(yàn)以及多肽抑制劑sHt31驗(yàn)證RAI16與PKA-RⅡα之間的相互作用。
　　4、利用Scansite Motif Scanner預(yù)測RAI16與HSP70的磷酸化位點(diǎn)。
　　5、利用單氨基酸突變、免疫共沉淀、Western Blottin

7、g、磷酸化分析、放射自顯影等技術(shù)檢測HSP70以及RAI16的磷酸化。
　　6、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡百分比。
　　研究結(jié)果:
　　1、外源及內(nèi)源RAI16均可與PKA-RⅡα互作;RAI16 Aa352-370可與PKA-RⅡα D/D結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并可形成兩性α螺旋，是AKB結(jié)構(gòu)域。RAI16是一個新型的AKAP(A-kinase anchoring protein，A型激酶錨定蛋白)。
　　2、外源及內(nèi)源

8、RAI16均可與HSP70發(fā)生互作;RAI16中部的Aa251-500可與HSP70 C端Aa441-641結(jié)合;并且RAI16可介導(dǎo)PKA對HSP70的第486位絲氨酸的磷酸化，促進(jìn)HSP70的抗凋亡作用。RAI16 Aa251-500片段存在AKAP靶向結(jié)構(gòu)域。
　　3、外源及內(nèi)源的RAI16均可與14-3-3θ發(fā)生相互作用;RAI16的Aa251-500可與14-3-3θ的Aa81-160結(jié)合。RAI16 Aa251-500

9、片段存在AKAP與其它信號分子結(jié)合區(qū)域。
　　4、RAI16的第325位絲氨酸可被PKA磷酸化;并且RAI16自身磷酸化促進(jìn)其與14-3-3θ互作。RAI16與14-3-3θ的相互作用依賴RAI16/PKA-RⅡα復(fù)合物的形成。
　　5、RAI16與14-3-3θ結(jié)合后，可抑制RAI16介導(dǎo)的PKA對HSP70的磷酸化。
　　結(jié)論:
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)RAI16可作為支架蛋白AKAP將PKA定位至特定的亞細(xì)胞區(qū)室

10、，實(shí)現(xiàn)對特異性底物的磷酸化，調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。RAI16可介導(dǎo)PKA磷酸化HSP70，同時RAI16自身也會被PKA磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)其對14-3-3θ的招募，反過來，抑制RAI16介導(dǎo)的PKA對HSP70的磷酸化。所以RAI16可能通過參與HSP70相關(guān)的抗凋亡信號途徑發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步解釋了RAI16在HCC中介導(dǎo)抗凋亡的作用機(jī)制。
　　二、SNORD113-1對HCC發(fā)生發(fā)展的抑制作用及機(jī)制研究
　　SnoRNAs(sma

11、ll nucleolar RNAs)是一類長60～300個核苷酸的小分子非編碼RNA，其主要存在于核仁，作為guide RNA調(diào)節(jié)核糖體RNA以及一些剪切體RNA的轉(zhuǎn)錄后修飾。SNORD113-1(Small nucleolar RNA113-1)是長70個核苷酸的snoRNA分子，結(jié)構(gòu)上屬于C/D box snoRNA，基因位于14號染色體的Dlk1-Dio3區(qū)，其在臨床HCC腫瘤中的表達(dá)水平與作用，尚未見報道。
　　研究方法:

12、
　　1、收集臨床肝細(xì)胞癌患者的腫瘤與癌旁組織樣本，利用micro-array和qRT-PCR技術(shù)檢測SNORD113-1在組織樣本中的表達(dá)水平。
　　2、根據(jù)提供樣本的HCC患者臨床病理信息，進(jìn)行統(tǒng)計分析，研究SNORD113-1對HCC患者術(shù)后生存的預(yù)測價值以及與臨床病理特征的相關(guān)性。
　　3、利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)，分析SNORD113-1基因的啟動子區(qū)域。
　　4、利用亞硫酸鈉測序技術(shù)檢測SNORD113

13、-1啟動子區(qū)CpG島的甲基化水平。
　　5、利用表達(dá)質(zhì)粒與小干擾RNA，過表達(dá)或敲低SNORD113-1的表達(dá)水平，利用Cell Titer-Blue、克隆形成分析、細(xì)胞流式技術(shù)、Transwell遷移小室、Matrigel侵襲小室檢測SNORD113-1對肝細(xì)胞癌細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、遷移與侵襲的影響。
　　6、利用裸鼠皮下荷瘤模型，研究SNORD113-1對肝細(xì)胞癌細(xì)胞在體增殖的影響。
　　7、利用癌癥

14、相關(guān)信號通路分析、Western Blotting技術(shù)，研究SNORD113-1對MAPK/ERK以及TGF-β等信號通路的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1、在112對HCC腫瘤與癌旁組織樣本中，SNORD113-1在77.6％的腫瘤組織中明顯下調(diào)。
　　2、腫瘤組織中SNORD113-1低表達(dá)的HCC患者，中位生存期（68.4個月）明顯低于SNORD113-1高表達(dá)的HCC患者（99.8個月）。SNORD113-1低表

15、達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。
　　3、SNORD113-1基因位于14號染色體，軟件預(yù)測以及熒光素酶報告系統(tǒng)均顯示14號染色體的F1(82370922～82371234)區(qū)具有很強(qiáng)的啟動子活性，可能是SNORD113-1的啟動子區(qū)。
　　4、HCC腫瘤組織的F1片段中，44.4％的CpG島發(fā)生了超甲基化，明顯高于癌旁組織。SNORD113-1在HCC組織中低表達(dá)是由其啟動子區(qū)域的超甲基化引起的。
　　5、過表達(dá)SNO

16、RD113-1可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，影響細(xì)胞周期，使更多的細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的S期;敲低SNORD113-1可促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，使更多的細(xì)胞在細(xì)胞周期的G2-M期。對細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲無明顯影響。
　　6、裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)證明，敲低SNORD113-1的HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的瘤體顯著大于對照組;過表達(dá)SNORD113-1的HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的瘤體顯著小于對照組。
　　7、敲低SNORD113-1可促進(jìn)MAPK/ERK信

17、號通路中MEK、ERK1/2以及TGF-β信號通路中SMAD2/3的磷酸化水平;過表達(dá)SNORD113-1可顯著抑制MAPK/ERK信號通路中MEK、ERK1/2以及TGF-β信號通路中SMAD2/3的磷酸化水平。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)，HCC時SNORD113-1啟動子區(qū)CpG島發(fā)生的超甲基化，致SNORD113-1表達(dá)下調(diào)，SNORD113-1的低表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。機(jī)制研究表明，SN

18、ORD113-1對HCC腫瘤的抑制作用是通過調(diào)控MAPK/ERK信號通路中MEK、ERK1/2以及TGF-β信號通路中SMAD2/3的磷酸化水平實(shí)現(xiàn)的。
　　三、小結(jié)
　　本研究通過人類轉(zhuǎn)錄本分析，發(fā)現(xiàn)了RAI16與SNORD113-1在HCC中差異表達(dá)，進(jìn)一步的功能與機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)兩者對HCC分別具有促進(jìn)和抑制作用。
　　(1)首次發(fā)現(xiàn)，RAI16對HCC的促進(jìn)作用是通過其作為支架蛋白AKAP，將PKA定位至特定的亞細(xì)

19、胞區(qū)室，磷酸化HSP70實(shí)現(xiàn)的。并且，RAI16可同時與PKA、14-3-3θ結(jié)合，形成多分子復(fù)合物，協(xié)同調(diào)節(jié)HSP70的磷酸化，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)信號通路的精確調(diào)控。
　　(2)首次發(fā)現(xiàn)SNORD113-1對HCC具有抑制作用。證明SNORD113-1對HCC的抑制作用是通過調(diào)控MAPK/ERK信號通路中MEK、ERK1/2以及TGF-β信號通路中SMAD2/3的磷酸化實(shí)現(xiàn)的。
　　本文通過對RAI16在HCC中抗凋亡機(jī)制的研究