MiR-128a在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制的探討.pdf

1、背景及目的：
　　肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，己超過(guò)74.8萬(wàn)/年，居于惡性腫瘤的第5位;死亡接近70萬(wàn)/年，位居腫瘤相關(guān)死亡的第2位。世界上一半以上的肝癌新發(fā)病例發(fā)生在中國(guó)。在我國(guó)大多數(shù)肝癌患者起病隱匿，早期幾乎無(wú)明顯癥狀，但病情進(jìn)展迅速，確診時(shí)大多數(shù)患者已經(jīng)達(dá)到局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療困難且預(yù)后很差。目前雖然在早期診斷、肝移植和早期肝癌切除

2、術(shù)方面取得了重要進(jìn)展，但HCC卻是僅次于肺癌的第二大癌癥殺手。因此，肝癌嚴(yán)重危害我國(guó)人民的健康和生命。
　　越來(lái)越多的研究表明:肝癌的發(fā)生發(fā)展是一系列復(fù)雜、多步驟的連續(xù)過(guò)程。其中抑癌基因與癌基因表達(dá)失調(diào)是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要一環(huán)，如抑癌基因TP53、AXIN1/2、APC、PTEN等的失活或表達(dá)量降低以及癌基因β-catenin、TGF-β、c-myc等的激活或表達(dá)量的增加與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。雖然如此，這些基因卻還不能作為肝癌

3、早期診斷和預(yù)后判斷有效的分子標(biāo)志物。因此，尋找可以輔助肝癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷、精準(zhǔn)治療及判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物以及研究肝癌發(fā)病的分子機(jī)制仍是肝癌研究的重要內(nèi)容。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一群高度保守的小片段非蛋白編碼RNA分子，長(zhǎng)度為18至25個(gè)核苷酸，在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控中發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多的研究表明miRNAs在許多生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，miRNAs通過(guò)與其靶基因相互作用在機(jī)體內(nèi)組成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)生物

4、體的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、增殖、凋亡、免疫活動(dòng)和疾病發(fā)生過(guò)程等進(jìn)行精確調(diào)控。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs的突變或失調(diào)與人類多種腫瘤相關(guān)，這些差異表達(dá)的miRNAs調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞分化、增殖、細(xì)胞凋亡和血管生成等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，可能代表腫瘤的生物特性的改變，而且差異表達(dá)miRNAs可作為腫瘤診斷、治療及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。
　　微小RNA-128(miR-128)是一種在正常腦神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)的miRNA，在

5、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及正常生理功能的維持中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，miR-128在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌和前列腺癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)其靶基因如促癌基因Bmi-1，EGFR，p70S6K1，E2F3a等發(fā)揮抑癌作用。近年研究證實(shí)，miR-128的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-128在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其表達(dá)的失調(diào)還與骨肉瘤、直腸癌等腫瘤患者的臨床預(yù)后相關(guān)，并與宮頸癌患者對(duì)順鉑化療耐藥情

6、況相關(guān)。而在膠質(zhì)瘤中，miR-128可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療敏感性增加。上述的研究結(jié)果預(yù)示著miR-128可能成為具有潛在價(jià)值的重要腫瘤標(biāo)志物，與腫瘤診斷、治療和預(yù)后相關(guān)，并有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。
　　本研究首先應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)miR-128a在肝細(xì)胞癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平的變化。然后通過(guò)MTT方法檢測(cè)經(jīng)miR-128a mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞增殖活力變化，探討miR-128a在

7、肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，進(jìn)而通過(guò)軟件預(yù)測(cè)、雙熒光素酶試驗(yàn)、qRT-PCR及Western blot闡明了其在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能的作用機(jī)制。最后應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)62例肝癌組織中miR-128a的表達(dá)，分析其表達(dá)與肝癌預(yù)后、臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系，明確miR-128a能否成為判斷肝癌預(yù)后的分子靶標(biāo)，為進(jìn)一步尋找肝癌早期診斷、預(yù)后判斷、確定治療決策的新的分子標(biāo)志物及靶向治療提供了理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、肝癌組

8、織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-128a表達(dá)水平的分析
　　利用qRT-PCR方法檢測(cè)來(lái)自19例患者的肝癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-128a的表達(dá)水平。采用配對(duì)t檢驗(yàn)的方法比較肝癌組織及其癌旁組織中miR-128a的表達(dá)水平有無(wú)差異。所有肝癌組織均為術(shù)后新鮮標(biāo)本，診斷經(jīng)病理證實(shí)。
　　2、miR-128a在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制
　　運(yùn)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectaminTM RNAiMA

9、X介導(dǎo)miR-128a inhibitor或mimic轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株，然后采用TRizol法提取肝癌細(xì)胞RNA，并采用qRT-PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)染后miR-128a在肝癌細(xì)胞中的表達(dá);接著利用MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞增殖能力的變化。最后我們用TargetScan Human6.2，miRanda，PicTar等公用在線軟件對(duì)miR-128a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，選出兩個(gè)以上軟件同時(shí)預(yù)測(cè)到的靶基因，結(jié)合miR-128a促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的生

10、物學(xué)功能，選出miR-128a可能的靶基因RND3，采用雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-128a和RND3之間相互作用。并在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或干擾miR-128a后，利用qRT-PCR及Western blot方法檢測(cè)RND3及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化。
　　3、miR-128a表達(dá)水平在肝癌中的作用意義
　　利用qRT-PCR方法檢測(cè)62例肝癌石蠟組織標(biāo)本中miR-128a的表達(dá)水平，應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析

11、法分析miR-128a對(duì)肝癌預(yù)后的影響;采用Spearman秩相關(guān)分析miR-128a表達(dá)與肝癌各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性;運(yùn)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)各臨床病理參數(shù)、miR-128a表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行單因素與多因素分析，明確miR-128a是否可以作為肝癌發(fā)病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。
　　結(jié)果：
　　1、肝癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-128a表達(dá)水平的分析
　　我們用qRT-PCR方法檢測(cè)了在19對(duì)肝癌組織及其對(duì)應(yīng)癌

12、旁組織中miR-128a的表達(dá)水平，采用配對(duì)t檢驗(yàn)的方法比較肝癌及其對(duì)應(yīng)癌旁組織miR-128a的表達(dá)水平有無(wú)差異。結(jié)果表明肝癌組織中miR-128a表達(dá)水平高于肝癌癌旁組織中miR-128a表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、miR-128a在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制
　　采用miR-128a mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，運(yùn)用qRT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，結(jié)

13、果提示肝癌細(xì)胞miR-128a表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染miR-128a mimic組中相應(yīng)升高，而在轉(zhuǎn)染miR-128a inhibitor組中相應(yīng)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;運(yùn)用MTT法檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中miR-128a過(guò)表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的增殖能力明顯增加，相反當(dāng)對(duì)肝癌細(xì)胞miR-128a干擾表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的增殖能力下降(P＜0.001)。接著用TargetScan Human6.2，miRanda和Pic

14、 Tar等公用在線軟件對(duì)miR-128a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TargetScan Human6.2和miRanda兩個(gè)軟件中可同時(shí)預(yù)測(cè)到RND33'UTR區(qū)存在與miR-128a的保守作用位點(diǎn)。我們進(jìn)一步應(yīng)用雙熒光素酶基因報(bào)告試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證miR-128a與RND33'UTR之間的相互作用，結(jié)果表明，在RND33，UTR野生型組中，轉(zhuǎn)染了miR-128a的肝癌細(xì)胞的熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染nc組肝癌細(xì)胞的熒光素酶活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)

15、學(xué)意義(P＜0.01)。而在RND33'UTR突變型組中無(wú)明顯變化。這些結(jié)果證明miR-128a可直接作用于RND33'UTR區(qū)。另外，在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-128a后，RND3 mRNA水平及蛋白水平均相應(yīng)減少，而在肝癌細(xì)胞中干擾miR-128a表達(dá)后，RND3 mRNA水平及蛋白水平均相應(yīng)增加，這進(jìn)一步證實(shí)miR-128a靶向調(diào)控RND3促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。我們?cè)诟伟┘?xì)胞中抑制miR-128a表達(dá)后，采用Western blot方

16、法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cyclin B1，cyclin D1和CDK4的表達(dá)下調(diào)，這些結(jié)果提示miR-128a促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖可能是通過(guò)靶向調(diào)控RND3進(jìn)而影響細(xì)胞周期進(jìn)展來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　3、miR-128a在肝癌中作用意義
　　我們應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)了62例肝癌石蠟標(biāo)本中miR-128a的表達(dá)情況，再應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析miR-128a的表達(dá)情況與肝癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-128a

17、表達(dá)只與AST密切相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)、肝癌巴塞羅那分期、門脈癌栓、腫瘤數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血清AFP、肝硬化、HBS-Ag、ALT、ALB及腫瘤復(fù)發(fā)均無(wú)顯著相關(guān)性。生存分析發(fā)現(xiàn)無(wú)論肝癌患者有無(wú)復(fù)發(fā)，miR-128a的表達(dá)均未發(fā)現(xiàn)與肝癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)各臨床病理參數(shù)、miR-128a表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行單因素與多因素分析，只發(fā)現(xiàn)AST及肝癌巴塞羅那分期為肝癌的危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)論：<