新分子Mir-216b在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中作用機(jī)理的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 研究在肝細(xì)胞癌家族史患者與健康無(wú)肝細(xì)胞癌家族史志愿者血漿間microRNA表達(dá)譜的不同
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接懜渭?xì)胞癌家族史患者與健康無(wú)肝細(xì)胞癌家族史志愿者血漿間microRNA表達(dá)譜的不同。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、從華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院肝臟外科的既往就診患者中，挑選患有肝細(xì)胞癌的患者，進(jìn)行嚴(yán)格的篩查，從中選出直系親屬（如父母、兄弟姐妹和子女）也患有肝細(xì)胞癌的患者

2、，利用復(fù)查或住院手術(shù)期間，告知其實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮?，簽署知情同意?shū)后，采集他們的外周靜脈血。血液樣品采集后置入含有EDTA成分的抗凝試管中，隔絕空氣于4℃低溫貯存，在采集樣本后1小時(shí)內(nèi)，經(jīng)過(guò)離心法提取上清血漿成分，馬上貯存于-80℃的低溫冰箱中。
　　2、患者血漿樣品與同時(shí)提取的無(wú)肝細(xì)胞癌家族史健康志愿者的血漿樣品，存放于含有液氮的低溫罐中，經(jīng)飛機(jī)運(yùn)送到上海博豪生物有限公司。使用最新的基于16.0數(shù)據(jù)庫(kù)的microRNA芯片進(jìn)行兩組間篩查

3、對(duì)比。由microRNA芯片所獲得的的結(jié)果，經(jīng)過(guò)與健康志愿者對(duì)比分析，選出在肝癌家族史患者血漿中變化一致的miRNAs，而且表達(dá)量變化超過(guò)20倍的幾種miRNA。
　　3、查閱大量文獻(xiàn)，選擇目前尚未在肝癌中報(bào)道過(guò)的miRNA進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、共收集到肝細(xì)胞癌家族史患者3例，患者中都至少有一個(gè)直系親屬同時(shí)患有肝細(xì)胞癌，各提取外周靜脈血5ml。經(jīng)過(guò)高速離心后，提取上清黃色透明液體，每例標(biāo)本均提取淡

4、黃色血漿3ml左右，貯存于高溫處理和去 RNA酶處理的1.5mlEP管中，保存于-80℃。
　　2、經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的三次實(shí)驗(yàn)比對(duì)，共檢出46種差異表達(dá)的microRNA，其中三例標(biāo)本表達(dá)變化趨勢(shì)一致的共有27個(gè)。
　　3、表達(dá)量變化超過(guò)20倍的共有14個(gè)，其中在肝細(xì)胞癌家族史患者血漿中表達(dá)升高的有12中，降低的有2中，而這14種miRNA均未在肝癌中報(bào)道過(guò)。
　　第二部分 在兩組間血漿中表達(dá)差異明顯的microRNA在其他肝

5、癌患者血漿中的驗(yàn)證
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)RT-PCR法驗(yàn)證芯片結(jié)果，并且擴(kuò)大樣本，引入非肝細(xì)胞癌家族史病人的血液標(biāo)本，從而驗(yàn)證芯片所獲結(jié)果的實(shí)用和有效性。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、選擇在2012年11月到2013年4月因肝細(xì)胞需要行手術(shù)治療的患者10例，術(shù)前告知患者實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，簽署知情同意?shū)后，采集外周靜脈血樣品5ml。同樣的方式采集10例無(wú)乙型肝炎的肝血管瘤患者的外周靜脈血5ml。血液樣品采集后置入含有EDTA成分的抗凝

6、試管中，隔絕空氣于4℃低溫貯存，在采集樣本后1小時(shí)內(nèi)，經(jīng)過(guò)離心法提取上清血漿成分，馬上貯存于-80℃的低溫冰箱中。
　　2、使用ABI Ambion公司的mirVana PARIS試劑盒，進(jìn)過(guò)多步離心純化，提出血漿樣品中的全部miRNA后，以無(wú)RNA酶水溶解后置入經(jīng)過(guò)高溫高壓及無(wú)RNA處理過(guò)的1.5mlEP管中，貯存于-80℃條件下。提取后的miRNA樣品，使用Toyobo公司的ReverTra Ace qPCR RT Maste

7、r Mix試劑盒，加入Invitrogen公司定制的miRNA頸環(huán)引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得所有miRNA的cDNA樣品，貯存于-20℃冰箱中。
　　3、上一步驟獲得的cDNA樣品，使用Invitrogen公司定制的miRNA上下游引物，同時(shí)使用Takara公司的One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒，于ABI Step-one RT-PCR機(jī)中，進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)時(shí)定量檢測(cè)目的miRNA的表達(dá)。使用

8、2-ΔΔct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再利用T檢驗(yàn)比較兩組間表達(dá)量的的差異，最后得出的結(jié)果與芯片結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選，術(shù)后肝癌組織經(jīng)過(guò)病理檢查，確診為原發(fā)性肝細(xì)胞的患者的血液樣本采集完畢，患者對(duì)實(shí)驗(yàn)均知情同意，簽字同意。10例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血液樣本標(biāo)號(hào)為1-10，同時(shí)，在此期間住院手術(shù)的肝血管瘤患者，確定無(wú)肝癌家族史及乙肝病史的10例患者也篩選完畢，同時(shí)采集血液樣品。經(jīng)

9、過(guò)多步離心，使用高溫高壓滅菌和無(wú)RNA酶化處理過(guò)的試管、槍頭處理樣品，每個(gè)樣品均獲得3ml左右淡黃色半透明血漿樣品，提取過(guò)程均在低溫下進(jìn)行。
　　2、取適量血漿樣品，經(jīng)過(guò)多步離心、洗滌、純化和溶解后，每400μL血漿樣品獲得濃度約1μg/μL的Total RNA樣品30μl。貯存于高溫高壓滅菌和無(wú)RNA酶化處理過(guò)的EP管內(nèi)，-80℃保存。獲得的RNA樣品，吸取1-2μL左右，使用Toyobo公司的ReverTra Ace qPCR

10、 RT Master Mix反應(yīng)體系，加入針對(duì)各類miRNA的頸環(huán)引物，使用PCR儀，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得每個(gè)樣本的cDNA樣品10μL。由于miRNA的特殊性，第一部分實(shí)驗(yàn)篩查出的14種miRNA，必須分別加入特定的頸環(huán)引物，所以這20個(gè)患者共獲得cDNA樣品280個(gè)。貯存于-20℃下。
　　3、上一步獲得的cDNA樣品，使用Invitrogen公司定制的miRNA上下游引物，同時(shí)使用Toyobo公司的SYBR Green Re

11、altime PCR Master Mix-Plus試劑盒，于ABI Step-one RT-PCR機(jī)中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，所得數(shù)據(jù)記錄在電腦中，經(jīng)過(guò)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化。每個(gè)樣本的每一種miRNA樣品的RT-PCR實(shí)驗(yàn)都重復(fù)三遍，每次都有兩個(gè)附孔。使用2-ΔΔct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，再與所獲得的芯片結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)芯片結(jié)果得到驗(yàn)證，這10例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者組與10例肝血管瘤患者組的14種miRNA的表達(dá)量的變化都與芯片結(jié)果一直，但是表達(dá)

12、量的差異程度略小于芯片結(jié)果。經(jīng)過(guò)更大樣本的驗(yàn)證，芯片所獲得結(jié)果真實(shí)可靠，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　第三部分 miR-216b在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的癌組織中的表達(dá)量與癌旁肝組織中的表達(dá)量的變化，并與血漿芯片結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)研究miR-216b的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模豪^續(xù)使用RT-PCR法對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞患者手術(shù)標(biāo)本中的miRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，選出代表性的miRNA進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　實(shí)

13、驗(yàn)方法：
　　1、對(duì)前幾部分實(shí)驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從中選擇出表達(dá)差異最為明顯的miRNA進(jìn)行組織中表達(dá)量的進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　2、隨機(jī)選取從2008.4-2013.4在本院住院手術(shù)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者50例，術(shù)中標(biāo)本按癌組織和癌旁肝組織進(jìn)行取材，低溫貯存于液氮中運(yùn)輸，分裝后-80℃貯存。這50對(duì)標(biāo)本，進(jìn)行勻漿、離心等多部實(shí)驗(yàn)，提取出樣品total RNA。
　　3、查閱大量文獻(xiàn)后，選取miRNA-216b進(jìn)行下一步研

14、究，上述步驟所取得的RNA樣品，使用 Toyobo公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒，加入Invitrogen公司定制的miRNA-216b頸環(huán)引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA樣品，貯存于-20℃冰箱中。獲得的cDNA樣品，使用Invitrogen公司定制的miRNA-216b上下游引物，同時(shí)使用Toyobo公司的SYBR?Green Realtime PCR Master Mix-Plus試劑盒

15、，于ABI Step-one RT-PCR機(jī)中，進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)時(shí)定量檢測(cè)miRNA-216b的表達(dá)。
　　4、上述結(jié)果，使用2-ΔΔct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再利用 T檢驗(yàn)比較癌組織與癌旁組織的表達(dá)量的差異。
　　5、結(jié)合患者臨床病理資料，比較不同病理分期、腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理因素對(duì)于miRNA-216b的表達(dá)的影響。
　　6、對(duì)于上述患者進(jìn)行隨訪，調(diào)查術(shù)后患者生存情況、復(fù)發(fā)情況，從而研究miRNA-216b的表達(dá)

16、與患者術(shù)后預(yù)后的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、經(jīng)過(guò)查閱大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)miR-216b從未在肝癌中被報(bào)導(dǎo)過(guò)。芯片結(jié)果也顯示，它在肝細(xì)胞癌家族史患者血漿中的表達(dá)與無(wú)家族史健康志愿者血漿中的表達(dá)差異最為明顯，降低約122倍。說(shuō)明這可能是一個(gè)抑癌基因，所以挑選它作為繼續(xù)研究的靶點(diǎn)。
　　2、選取30-60之間的患者，于術(shù)中采集新鮮的肝癌及癌旁組織標(biāo)本，貯存于-80℃。以trizol提取組織Total RNA樣品，每個(gè)樣品各獲

17、得RNA30μL，濃度約1μg/μL。立即進(jìn)行下一步逆轉(zhuǎn)錄或凍存于-80℃冰箱中。
　　3、4使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒和miRNA-216b頸環(huán)引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，每個(gè)樣品共獲得特殊的cDNA10μL，濃度約1μg/μL。再經(jīng)過(guò)RT-PCR法，測(cè)量出miR-216b在癌旁與癌組織的表達(dá)量，再經(jīng)過(guò)T檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)75％的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的癌旁組織的miR-216b的表達(dá)量明顯高于癌組織，而

18、平均的表達(dá)量差異約為4.45倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　4、按照患者的miR-216b的癌組織中的表達(dá)量，和作為參照物的肝血管瘤患者正常肝組織標(biāo)本中miR-216b的表達(dá)量對(duì)比，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。結(jié)合臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)miR-216b低表達(dá)組的腫瘤的明顯大于高表達(dá)組，門脈癌栓也明顯多于低表達(dá)組。兩組構(gòu)成比進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。其余臨床病理資料，兩組間差異不明顯。
　　5、隨訪兩

19、組患者，發(fā)現(xiàn)miR-216b高表達(dá)組患者的術(shù)后五年總生存率和無(wú)瘤生存率分別是65％和57％，而 miR-216b低表達(dá)組的術(shù)后五年總生存率和無(wú)瘤生存率分別是37％和28％。兩組間差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。
　　第四部分 miR-216b對(duì)于肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯縨iR-216b對(duì)于肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

20、
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、RT-PCR法檢測(cè)肝細(xì)胞癌各細(xì)胞系中miR-216b的表達(dá)量，從中選擇出表達(dá)量最高和最低的進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　2、在lipo2000介導(dǎo)下，進(jìn)行RNA干擾，以miR-216b mimics轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后使用RT-PCR法檢測(cè) miR-216b的表達(dá)。類似的步驟，以miR-216b inhibitor轉(zhuǎn)染SMCC-7721細(xì)胞，再用RT-PCR法檢測(cè)miR-216b的表達(dá)。

21、　　3、進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞和SMCC-7721細(xì)胞的增殖能力。
　　4、進(jìn)行軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞和SMCC-7721細(xì)胞的非錨定增殖能力。
　　5、進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞和SMCC-7721細(xì)胞的遷移能力。
　　6、進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞和SMCC-7721細(xì)胞的侵襲能力。
　　7、HepG2細(xì)胞和 SMCC-

22、7721細(xì)胞分成兩組，種植于裸鼠皮下，進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。其中HepG2細(xì)胞組給予miRNA mimics瘤內(nèi)注射，SMCC-7721細(xì)胞給予miRNA inhibitor瘤內(nèi)注射。注射期間測(cè)量腫瘤的體積，三周后測(cè)量腫瘤的重量，在體內(nèi)試驗(yàn)中檢測(cè)miR-216b的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、經(jīng)過(guò)RT-PCR檢測(cè)，miR-216b在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)以 HepG2細(xì)胞為最低，以SMCC-7721細(xì)胞表達(dá)量為最高，所以選擇這兩

23、個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　2、轉(zhuǎn)染mimics后，與對(duì)照組相比較，miR-216b在HepG2中的表達(dá)明顯升高；轉(zhuǎn)染inhibitor后，與對(duì)照組相比較，miR-216b在SMCC-7721中的表達(dá)明顯降低。證明這兩個(gè)RNA干擾試劑的有效性。
　　3、經(jīng)過(guò)mimics轉(zhuǎn)染后，在7天內(nèi)觀察HepG2細(xì)胞的增殖情況，第三天的時(shí)候，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較，它的增殖明顯受到增強(qiáng)，一直到第七天，增強(qiáng)程度逐漸增加，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

24、(p<0.05）。經(jīng)過(guò) inhibitor轉(zhuǎn)染后，在7天內(nèi)觀察SMCC-7721細(xì)胞的增殖情況，第三天的時(shí)候，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較，它的增殖明顯受到抑制，一直到第七天，受抑制程度逐漸增加，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　4、經(jīng)過(guò)mimics轉(zhuǎn)染后，在兩周內(nèi)觀察HepG2細(xì)胞的非錨定增殖情況，兩周后，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較，它所形成的的克隆的個(gè)數(shù)和大小都明顯大于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。經(jīng)過(guò) inhib

25、itor轉(zhuǎn)染后，在兩周內(nèi)觀察 SMCC-7721細(xì)胞的非錨定增殖情況，兩周后，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較，它所形成的的克隆的個(gè)數(shù)和大小都明顯小于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　5、經(jīng)過(guò)mimics轉(zhuǎn)染后，在48小時(shí)內(nèi)觀察HepG2細(xì)胞移動(dòng)能力，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較，它的劃痕的愈合速度明顯快于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。經(jīng)過(guò)inhibitor轉(zhuǎn)染后，在48小時(shí)內(nèi)觀察SMCC-7721細(xì)胞的移動(dòng)能力，轉(zhuǎn)

26、染組與對(duì)照組比較，它的劃痕的愈合速度明顯慢于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　6、經(jīng)過(guò)mimics轉(zhuǎn)染后，在48小時(shí)內(nèi)觀察HepG2細(xì)胞通過(guò)matrigel的侵襲能力，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較，它進(jìn)入到下層小室的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。經(jīng)過(guò)inhibitor轉(zhuǎn)染后，在48小時(shí)內(nèi)觀察SMCC-7721細(xì)胞通過(guò)matrigel的侵襲能力，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較，它進(jìn)入到下層小室的細(xì)胞數(shù)明

27、顯少于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　7、裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)至21天，它的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，mimics組和inhibitor組的細(xì)胞形成的皮下瘤生長(zhǎng)速度在21天后明顯低于和高于各自的對(duì)照組(p<0.01);第21天，mimics組腫瘤直徑(2.40士0.41cm3)和inhibitor組腫瘤直徑(1.60士0.21cm3)形成皮下瘤的平均體積與各自對(duì)照組腫瘤體積(1.19士0.29 cm3)和(2.07士0.2

28、4cm3)相比明顯減低(p　　第五部分 miR-216b對(duì)于肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響的機(jī)制研究
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

29、的：探討miR-216b對(duì)于肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、因?yàn)閙iRNA主要作用于目的基因的3’UTR區(qū)域，從而影響該基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。使用miRbase等數(shù)據(jù)庫(kù)和算法，預(yù)測(cè)miR-216b的作用靶基因。
　　2、篩選出KRAS基因作為miR-216b的作用基因，預(yù)測(cè)miR-216b的結(jié)合位置和堿基序列。復(fù)制該基因3’UTR區(qū)域的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)miR

30、NA的作用序列的變異序列，作為對(duì)照組，進(jìn)行l(wèi)uciferase實(shí)驗(yàn)，以確定miR-216b是否可與該序列特異性結(jié)合。分別使用mimics和inhibitor作用于該序列，觀察結(jié)果。
　　3、使用RT-PCR法和western blotting法檢測(cè)KRAS在轉(zhuǎn)染mimics或inhibitor后的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。
　　4、使用RNA干擾技術(shù)，篩選出合適位點(diǎn)的KRAS基因的干擾基因，經(jīng)過(guò)瞬轉(zhuǎn)敲除KRAS的表達(dá)后

31、，再加入miR-216b的mimics和inhibitor，觀察敲除KRAS后對(duì)HepG2和SMCC-7721細(xì)胞增殖的影響。
　　5、miR-216b敲除或者過(guò)表達(dá)后，研究KRAS的下游基因，進(jìn)一步研究miR-216b的作用機(jī)理。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、經(jīng)過(guò)多個(gè)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)和算法預(yù)測(cè)，其中五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-216b可以作用在KRAS基因的3’UTR區(qū)，從而影響KRAS的蛋白表達(dá)，繼而影響它的下游通路，影響肝癌細(xì)胞

32、的增殖和轉(zhuǎn)移。
　　2、經(jīng)過(guò)luciferase實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-216b的mimics和inhibitor可以作用在KRAS基因的3’UTR區(qū)的特異位點(diǎn)，而該位點(diǎn)突變后，mimics和inhibitor對(duì)于3’UTR區(qū)的結(jié)合被抑制。
　　3、使用miR-216b的mimics轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，可以降低KRAS基因的蛋白表達(dá)量，與對(duì)照組見(jiàn)有明顯差異，而對(duì)于KRAS的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯影響，說(shuō)明miR-216b是作用于K

33、RAS的轉(zhuǎn)錄后過(guò)程。使用miR-216b的inhibitor轉(zhuǎn)染SMCC-7721細(xì)胞，可以升高KRAS基因的蛋白表達(dá)量，與對(duì)照組見(jiàn)有明顯差異，而對(duì)于KRAS的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯影響，進(jìn)一步說(shuō)明miR-216b是作用于KRAS的轉(zhuǎn)錄后過(guò)程。
　　4、敲除KRAS基因后，miR-216b的mimics和inhibitor對(duì)于HepG2細(xì)胞和SMCC-7721細(xì)胞的增殖的抑制和促進(jìn)作用消失，與對(duì)照組的增殖無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明mi

34、R-216b發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞的增殖作用，主要靠KRAS發(fā)揮作用。
　　5、使用miR-216b的mimics轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，可以降低KRAS下游p-AKT和p-ERK的表達(dá)。使用miR-216b的inhibitor轉(zhuǎn)染SMCC-7721細(xì)胞，可以升高KRAS下游的p-AKT和p-ERK的表達(dá)。從而說(shuō)明miR-216b對(duì)于肝癌增殖和轉(zhuǎn)移能力的產(chǎn)生影響的信號(hào)通路。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有的實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果都要重復(fù)三次，

35、前文所提到的所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來(lái)表示，同時(shí)應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組組間差異采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析(ANOVA)，而分類變量的比較一般采用卡方檢驗(yàn)，使用Kaplan Meier法對(duì)生存率進(jìn)行分析，認(rèn)定p<0.05為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　1、miR-216b在原發(fā)性肝細(xì)胞癌家族史患者的血漿中的表達(dá)量明顯低于健康志愿者。
　　2、miR-216b在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的癌組

36、織中的表達(dá)明顯低于癌旁肝臟組織中的表達(dá)。而且miR-216b在癌組織中的表達(dá)量高低與患者的腫瘤大小、門脈癌栓的有無(wú)以及術(shù)后的預(yù)后密切相關(guān)。
　　3、抑制或者過(guò)表達(dá)miR-216b可以在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和裸鼠體內(nèi)細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)中，影響肝癌細(xì)胞系的增殖。
　　4、抑制或者過(guò)表達(dá)miR-216b可以在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中影響肝癌細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。
　　5、miR-216b主要靠直接作用于KRAS基因，通過(guò)PI3K/ERK和AKT通