轉(zhuǎn)錄激活因子3在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：檢測轉(zhuǎn)錄激活因子3（Activating Transcription Factor3,ATF3）在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）組織中的表達(dá)，結(jié)合臨床病理特征，探討ATF3與HCC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性；構(gòu)建并制備過表達(dá)ATF3的慢病毒載體，觀察其介導(dǎo)的過表達(dá)ATF3對肝癌細(xì)胞株HepG2生物學(xué)行為的影響，闡明ATF3在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制；篩選及驗(yàn)證肝癌細(xì)胞中與ATF3相互結(jié)合的蛋白質(zhì)，探討

2、在HCC發(fā)生發(fā)展過程中調(diào)控ATF3發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制。
　　方法：（1）應(yīng)用RT-PCR，IHC和WB檢測并對比ATF3在肝癌標(biāo)本及正常肝組織中的蛋白及基因水平，結(jié)合相關(guān)的臨床病理參數(shù)，探討ATF3與HCC形成的相關(guān)性；（2）構(gòu)建并制備過表達(dá)ATF3的慢病毒載體，感染HepG2后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，對比過表達(dá)前后細(xì)胞增殖、遷移能力、周期狀態(tài)及凋亡情況的變化，探討ATF3在HC

3、C發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)細(xì)胞學(xué)機(jī)制；（3）應(yīng)用IP方法沉淀出Hep G2細(xì)胞中與ATF3相互結(jié)合的蛋白，并經(jīng)變性聚丙烯凝膠分析，與陰性對照比對，挑選出差異性的電泳條帶并進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，以篩選出ATF3可能的結(jié)合蛋白，再通過co-IP驗(yàn)證二者是否相互結(jié)合。利用肝癌組織，結(jié)合IHC及WB檢測并分析ATF3和篩選出的蛋白質(zhì)在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用，探討二者的相互作用與HC C發(fā)生發(fā)展可能的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　?。?）RT-

4、PCR相對定量檢測了53對HCC和10例正常肝組織中ATF3基因的水平，結(jié)果示ATF3在肝癌組織中的基因水平明顯低于遠(yuǎn)癌肝組織及正常肝組織（P＜0.0001），遠(yuǎn)癌肝組織與正常肝組織之間差異無顯著性（P＝0.6240）；臨床病理特征分組中，包膜侵犯的癌組織中ATF3基因水平低于無侵犯組（P＜0.05），而患者性別，腫瘤大小，脈管轉(zhuǎn)移，組織學(xué)分級(jí)，組織學(xué)類型，乙肝表面抗原狀態(tài)，AFP水平，BCLC分期，生存時(shí)間各分組中ATF3基因水平差異

5、無顯著性（P＞0.05）；
　?。?）IHC檢測了20對HCC和10例正常肝組織中ATF3蛋白的表達(dá)，結(jié)果示ATF3蛋白定于細(xì)胞核內(nèi)，陽性表達(dá)呈核內(nèi)棕褐色彌漫性表達(dá)，在肝癌組織中的染色弱于遠(yuǎn)癌肝組織及正常肝組織；
　?。?）WB相對定量檢測了53對HCC和10例正常肝組織中ATF3蛋白的水平，結(jié)果示ATF3在肝癌組織中的蛋白水平明顯低于遠(yuǎn)癌肝組織及正常肝組織（P＜0.05），遠(yuǎn)癌肝組織與正常肝組織之間差異無顯著性（P＝0.3

6、260）；臨床病理特征分組中，包膜侵犯的癌組織中ATF3蛋白水平低于無侵犯組（P＜0.05），而患者性別，腫瘤大小，脈管轉(zhuǎn)移，組織學(xué)分級(jí)，組織學(xué)類型，乙肝表面抗原狀態(tài)，AFP水平，BCLC分期，生存時(shí)間各分組中ATF3蛋白水平差異無顯著性（P＞0.05）；
　?。?）成功構(gòu)建過表達(dá)ATF3的慢病毒載體，進(jìn)行慢病毒包裝及滴度測定后，感染肝癌細(xì)胞株HepG2，隨即進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測，結(jié)果顯示

7、過表達(dá)ATF3的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)了增殖速度減慢，細(xì)胞凋亡加速，生長周期阻滯（P＜0.05），而細(xì)胞遷移能力改變不明顯（P＝0.262）；
　?。?）將過表達(dá)ATF3的Hep G2細(xì)胞及空載體感染的Hep G2細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行IP，以空載體組為對照，檢測出過表達(dá)組中表達(dá)水平呈現(xiàn)差異性的電泳條帶數(shù)條，送檢蛋白質(zhì)譜分析；
　?。?）蛋白質(zhì)譜分析后檢測出可能與ATF3存在相互結(jié)合關(guān)系的候選蛋白，經(jīng)Mas cot軟件分析及NCBI數(shù)據(jù)庫

8、檢索，得到候選蛋白肽段序列等信息，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Pumbed文獻(xiàn)，從功能明確的候選蛋白質(zhì)中，篩選出與ATF3最可能相關(guān)的結(jié)合蛋白Gelsolin（GSN）。
　?。?）應(yīng)用co-IP技術(shù)，驗(yàn)證了ATF3和GSN之間存在相互結(jié)合關(guān)系，通過IHC及WB檢測出HCC組織切片中ATF3及其相互結(jié)合蛋白GSN的表達(dá)模式一致；通過功能已明確的GSN蛋白及其與ATF3之間的相關(guān)性推測出ATF3在肝癌形成過程中發(fā)揮其作用的可能分子機(jī)制。
　

9、　結(jié)論：
　　（1）肝癌組織中的ATF3基因及蛋白表達(dá)水平低于遠(yuǎn)癌及正常肝組織，包膜受侵犯組織中的ATF3表達(dá)水平低于包膜無侵犯組織，推測ATF3在肝癌形成過程中扮演著抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的角色；
　?。?）過表達(dá)ATF3的HepG2細(xì)胞株出現(xiàn)了增殖速度減慢，細(xì)胞凋亡加速及生長周期阻滯，細(xì)胞遷移能力有減弱趨勢，推測ATF3通過抑制腫瘤細(xì)胞增長，加速腫瘤細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程的生物學(xué)行為發(fā)揮其抑制肝癌形成的作用；
　　（