組蛋白去乙?；?在胰腺癌發(fā)生機制中的作用研究.pdf

1、許多HDACs抑制劑如曲古抑菌素A(TSA)、丁酸酯等通過誘導細胞生長抑制、分化和凋亡而起到抗腫瘤作用。HDAC1抑制劑還可激活死亡受體通路而誘導細胞凋亡。在胰腺癌中TSA可誘導胰腺癌細胞株凋亡和抑制其增殖,并且和吉西他濱或蛋白酶體抑制劑PS-341合用有協(xié)同作用。另有文獻報道SAttA能誘導胰腺癌生長抑制和誘導凋亡。并且在胰腺癌活體動物模型中SAHA可以抑制異位胰腺癌的生長。所以我們認為HDAC1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能起到重要作用。

2、截止目前HDAC1在胰腺癌中的表達及其在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用研究尚無報道。因此有必要利用分子生物學的方法對HDAC1基因在胰腺癌組織中表達水平進行檢測,并通過siRNA干擾技術(shù)研究HDAC1在胰腺癌發(fā)生中的作用,及其對基因甲基化的影響,同時探討HDAC1 siRNA在胰腺癌中的治療作用,為胰腺癌的基因治療提供一個可選的候選位點。 一、HDACs mRNA在胰腺癌組織中的表達的研究 目的：檢測組蛋白去乙酰化酶家族在胰腺

3、癌組織和癌旁組織中的表達情況,探討組蛋白去乙酰化酶家族在胰腺癌中的作用。 材料和方法：收集手術(shù)切除的胰腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織共22例,通過real-timePCR法(SYBR GREEN法)檢測5例正常胰腺組織、22例胰腺癌患者癌組織和癌旁組織中組蛋白去乙?；讣易?HDAC1和HDAC3)的mRNA表達情況,分析組蛋白去乙?；讣易逶谝认侔┙M織和癌旁組織中的表達情況。 結(jié)果：以正常胰腺組織為對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)22例胰腺癌

4、患者HDAC1和HDAC3在癌組織中的mRNA表達均較癌旁組織高(RQ值分別為2.60(1.07～6.24)vs1.02,P=0.001;3.57(1.52～7.56)vs1.67(0.42～2.91),P=0.027。 結(jié)論：胰腺癌組織中HDAC1基因和HDAC3基因在mRNA水平上較胰腺癌旁組織表達高,HDAC家族的高表達可能是胰腺癌的特征之一。 二、HDAC1蛋白在胰腺癌中的表達及臨床病理學意義 目的：探討

5、HDAC1蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織中表達情況,并明確胰腺癌組織中HDAC1表達水平與臨床病理指標的關(guān)系。 材料和方法：收集2006年1月～2008年3月我院接受手術(shù)治療的30例胰腺癌患者的胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織,同時收集患者臨床資料。所有病例均經(jīng)病理診斷為胰腺導管腺癌。采用鏈菌素抗生物素-過氧化酶(streptavidin peroxidase,SP)免疫組織化學法檢測胰腺癌和相應(yīng)癌旁組織HDAC1蛋白表達。胞核染色判定為陽

6、性。隨機計數(shù)高倍鏡下至少500個細胞,如果病灶細胞數(shù)少于500個,則所有的細胞被計數(shù)。計算陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分值,無腫瘤細胞著色為陰性。分析胰腺癌組織HDAC1表達強度和臨床病理指標的關(guān)系。 結(jié)果:HDAC1在胰腺導管細胞癌細胞核染色,陽性細胞為棕黃色。在非腫瘤細胞中幾乎沒有陽性細胞發(fā)現(xiàn)。胰腺癌組HDAC1表達陽性率56.0％±23.2％,癌旁組織表達陽性率為7.4％±9.8％,兩組相比HDAC1表達陽性率有顯著性差異(P

7、<0.001)。胰腺癌HDAC1高表達組18例(≥56％),低表達組12例(<56％)。分析HDAC1蛋白表達強度與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,結(jié)果示HDAC1表達強度和TNM分期(P=-0.046)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.035),而與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤分化、神經(jīng)浸潤與否、CEA和CA199濃度無關(guān)。 結(jié)論:HDAC1蛋白在胰腺癌表達明顯較胰腺癌旁組織高,胰腺癌中HDAC1高表達在胰腺癌的侵襲力及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能起

8、到重要的作用。 三、HDAC1 siRNA對胰腺癌細胞株增殖及凋亡的影響 目的：探討HDAC1 siRNA對胰腺癌細胞株增殖及凋亡的影響,明確HDAC1在胰腺癌中的作用。 材料和方法：通過HDAC1 siRNA瞬間轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞株P(guān)aTu8988干擾HDAC1的表達。共分空白對照組,Negative siRNA組及HDAC1 siRNA組。采用real-timeRT-PCR檢測HDAC1 siRNA瞬間轉(zhuǎn)染對Pa

9、Tu8988細胞HDACl基因表達的影響；通過Western blotting檢測HDAC1 siRNA瞬間轉(zhuǎn)染對PaTu8988 HDAC1蛋白表達的影響；并通過WST-8法測定PaTu8988細胞瞬間轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA后的增殖情況,繪制細胞生長曲線；應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測HDAC1 siRNA瞬間轉(zhuǎn)染PaTu8988細胞后細胞周期及凋亡的影響。 結(jié)果：與空白對照組real-time RT-PCR檢測顯示胰腺癌細胞株P(guān)aT

10、u8988瞬間轉(zhuǎn)染,HDAC1 siRNA后HDAC1 mRNA表達量在HDAC1 siRNA干擾15nM、30nM組表達下降率分別為68％和54％,均顯著低于空白對照組(P=-0.013:P=0.025)和NegativesiRNA組(P=-0.002;P=-0.04);Western blot檢測顯示PaTu898細胞8瞬間轉(zhuǎn)染HDAC1siRNA后HDAC1蛋白的表達下降；WST-8法檢測顯示HDAC1 siRNA干擾48h時空白

11、對照組、15nM Negative siRNA組、30nM Negative siRNA組、15nM HDAC1siRNA干擾組及30nM HDAC1 siRNA干擾組的細胞吸光度分別為2.21±0.33、1.91±0.18、1.79±0.07、1.68±0.16及1.55±0.15,30nM HDAC1 siRNA干擾組與其他各組相比,差異有顯著性(P<0.05)。流式細胞術(shù)檢測顯示上述5組胰腺癌細胞凋亡率分別為4.25％±1.34％

12、、4.34％±1.67％、5.19％±0.31％、10.09％±1.36％和11.19％±6.07％,與空白對照組、Negative siRNA組相比,HDAC1 siRNA凋亡顯著增高(P<0.05),同時可見HDAC1 siRNA組出現(xiàn)細胞G0/G1和G2/M期阻滯(P<0.05)。 結(jié)論:HDAC1 siRNA能有效地抑制胰腺癌細胞株P(guān)aTu8988 HDAC1基因mRNA及蛋白的表達；HDAC1 siRNA在體外能通過G

13、0/G1和G2/M細胞周期阻滯有效抑制胰腺癌細胞的生長增殖,并誘導細胞凋亡。 四、HDAC1 siRNA對胰腺癌細胞甲基化水平及有關(guān)增殖凋亡基因的影響 目的：探討HDAC1 siRNA干擾對胰腺癌細胞株甲基化水平及有關(guān)增殖凋亡基因的影響。 材料和方法：通過HDAC1 siRNA瞬間轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞株P(guān)aTu8988干擾HDAC1的表達。提取siRNA干擾前后細胞DNA,并進行亞硫酸鹽處理。然后針對hLMH1基因進行

14、亞硫酸氫鹽測序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)?；厥占兓康漠a(chǎn)物,將其分別插入pMD18-T載體,化學轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌,在含氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB平板培養(yǎng)進行藍白斑篩選。對挑選的菌落進行鑒定后搖菌,菌液送檢測序,計算其甲基化位點的變化情況。同時采用real-time RT-PCR檢測HDAC1siRNA干擾前后原癌基因Bcl-2及抑癌基因Bax、p21的mRNA水平的變化。 結(jié)

15、果：胰腺癌細胞株P(guān)aTu8988瞬間轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA后hLMH1基因啟動子甲基化位點較空白對照組和Negative siRNA組減少,同時siRNA干擾48h時空白對照組、15 nM和30 nM Negative siRNA組、15 nM HDACl siRNA組和30 nM HDAC1siRNA組Bcl-2基因mRNA RQ值分別為1.00±0.11;0.82±0.07;0.67±0.02;0.57±0.02;0.77±0.

16、01(P=0.002),Bax基因mRNA水平分別為1.02±0.22:1.37±0.20;2.64±0.39;1.49±0.27;3.83±0.27(P<0.001),p21基因mRNA水平分別為1.05±0.36;5.19±0.17;7.35±0.07;7.12±0.67;9.29±1.22(P<0.001)。 結(jié)論:HDAC1 siRNA干擾能降低胰腺癌細胞株hLMH1基因甲基化水平,同時能抑制原癌基因Bcl-2表達,增加

17、抑癌基因Bax、p21的表達。 小結(jié):HDAC1在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用,尤其是對胰腺癌特異性基因甲基化有調(diào)控作用,在胰腺癌中是一個良好的抗癌作用靶位。HDAC1 siRNA可能是胰腺癌基因靶向治療的方法之一。 通過上述研究,本課題得出以下結(jié)論： 1、胰腺癌組織中HDAC1基因和HDAC3基因在mRNA水平上較胰腺癌旁組織表達增高。 2、HDAC1蛋白在胰腺癌中的表達明顯較胰腺癌旁組織高,胰腺癌

18、中HDAC1高表達在胰腺癌的侵襲力及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起到重要作用。 3、HDAC1 siRNA在體外能通過G0/G1和G2/M細胞周期阻滯有效抑制胰腺癌細胞的生長增殖,還可誘導細胞凋亡。 4、HDAC1 siRNA干擾能降低胰腺癌細胞株部分基因甲基化水平,同時能抑制原癌基因Bcl-2表達,增加抑癌基因Bax、p21的表達。 因此HDAC1有望成為胰腺癌基因治療的新靶點,有關(guān)于其他HDAC家族成員的功能和治療研究需要在