小鼠白血病抑制因子基因的克隆、表達(dá)及維持雞胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)的研究.pdf

1、本文用PCR方法克隆得到EGFP基因，通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建了pSecTag-EGFP分泌型真核表達(dá)載體，用以研究pSecTag/HygroB真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染雞胚胎成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染雞胚胎成纖維細(xì)胞，結(jié)果24h、48h后在熒光顯微鏡下能直接觀察綠色熒光蛋白基因的表達(dá)。用Bradford檢測法檢測正交優(yōu)化不同組合細(xì)胞培養(yǎng)液中所表達(dá)分泌的增強(qiáng)綠色熒光蛋白的相對含量。結(jié)果脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法能有效

2、轉(zhuǎn)染雞胚胎成纖維細(xì)胞，利用SAS軟件分析表明：蛋白表達(dá)相對含量與質(zhì)粒的多少呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，而與脂質(zhì)體的量無顯著相關(guān)性。本文運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，克隆含信號肽和不含信號肽的小鼠分泌型白血病抑制因子cDNA，通過pBS-T載體和pMDl8-T simple載體過渡，分別構(gòu)建了含mLIF信號肽真核表達(dá)載體pSecTag-mlif(sp+)和不含mLIF信號肽真核表達(dá)載體pSecTag-mlif(sp-)，酶切進(jìn)行初步鑒定。利用