人次級淋巴組織趨化因子(SLC)的克隆、表達和功能鑒定.pdf

1、次級淋巴組織趨化因子(Secondary Lymphoid-Tissue Chemokine,SLC),即CCL-21,是趨化因子(Chemokine)超家族成員.SLC通過其受體CCR7誘導T淋巴細胞和DC(dendritic cell)進入次級淋巴組織,并由DC提呈抗原,激活T淋巴細胞.因此SLC是引發(fā)特異性免疫反應的關鍵趨化因子之一.為此我們克隆了SLC成熟蛋白基因,構建了該基因的原核表達質粒,進行了重組蛋白的誘導表達、純化及生物

2、學活性的鑒定,旨在為進一步研究SLC在移植排斥反應、腫瘤發(fā)展與轉移和自身免疫性疾病中的作用機制及應用奠定基礎.該項研究取得的主要結果如下:1.通過從人扁桃體中提取總RNA,RT-PCR成功獲得編碼人SLC成熟蛋白的DNA片段(SLC超始密碼子下游第70-405base),并將該片段插入原核表達質粒pET32a(+),成功構建了重組原核表達質粒pET32a(+)/SLC(+3),通過突變去掉目的基因與腸激酶位點間的三個氨基酸,經(jīng)測序,與G

3、enBank上登錄的人SLC成熟蛋白cDNA序列(登錄號AB002409)完全一致,獲得SLC天然蛋白的重組原核表達質粒pET32a(+)/SLC.2.將該質粒轉化大腸桿菌BL21trxB(DE3),經(jīng)IPTG誘導,獲得了高水平表達的融合蛋白(TrxA-SLC),并確定融合蛋白在BL21trxB(DE3)中高效表達的最佳誘導條件為終濃度1mmol/L的IPTG在37℃誘導表達3小時.SDS-PAGE分析可見,表達蛋白的大小約為30kDa

4、,占菌體總蛋白的50﹪以上,可溶性蛋白約占50﹪.用羊抗人SLC多克隆抗體進行Western blot分析顯示,在30 kDa處出現(xiàn)單一陽性條帶,而對照的pET32a(+)/BL21trxB(DE3)誘導菌則無此反應.3.將大量表達的融合蛋白經(jīng)TALON金屬親和樹脂純化、除鹽、腸激酶消化、弱陽離子交換層析,得到電泳純的SLC重組蛋白.4.生物學活性分析顯示,所制備的重組SLC可在體外趨化外周血表達CCR7的淋巴細胞,可引起外周血表達CC