趨化因子RANTES在附睪的表達及功能研究.pdf

1、目的：
　　受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)是趨化因子超家族成員，該分子生物學(xué)功能復(fù)雜多樣。有報道發(fā)現(xiàn)RANTES存在于正常成人的精液中，但其組織細胞來源尚不清楚。本實驗?zāi)康脑谟谙到y(tǒng)地研究RANTES在男性生殖系統(tǒng)內(nèi)的表達及意義。
　　方法：
　　1．利用聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡雜交（Westernblot）、原位雜交、免疫組織化學(xué)及免疫熒光等方法，觀察RANTES及其受體在成年男

2、性生殖系統(tǒng)內(nèi)的表達和分布情況。
　　2．根據(jù)上述實驗結(jié)果，利用RT-PCR、實時定量RT-PCR，Westernblot及免疫組織化學(xué)等方法，觀察RANTES在小鼠附睪內(nèi)的表達分布。利用Westernblot檢測在小鼠發(fā)育不同階段（7、14、21、28、35、42、49、56和140天）RANTES表達水平的變化。
　　3．分離純化小鼠附睪各段精子，利用免疫熒光、流式細胞術(shù)等方法確定RANTES結(jié)合精子的部位及結(jié)合量。

3、>　　結(jié)果：
　　1．RT-PCR結(jié)果顯示RANTESmRNA在人前列腺和附睪有表達，但在睪丸和精子未見表達。Westernblot檢測到RANTES蛋白在人附睪頭部及尾部有高表達，在體部表達相對較低。原位雜交與免疫組化結(jié)果提示，表達RANTES的細胞為輸出小管的纖毛細胞、附睪管的狹窄細胞、頂細胞和基細胞。免疫熒光雙標(biāo)實驗利用特異性細胞標(biāo)記物，進一步證實了RANTES在附睪上皮的細胞定位。此外，RANTES受體CCR1和CCR5m

4、RNA在附睪均有表達，原位雜交及免疫組織化學(xué)實驗表明CCR5受體在附睪上皮廣泛表達。
　　2.RT-PCR結(jié)果提示RANTESmRNA在小鼠附睪都有表達，免疫組織化學(xué)實驗證明RANTES表達于小鼠輸出小管的纖毛細胞、附睪管的狹窄細胞和頂細胞。實時定量PCR和Westernblot證明RANTES表達量在小鼠附睪頭部最高，體部較少，尾部幾乎檢測不到。Westernblot顯示RANTES在小鼠出生后第28天開始出現(xiàn)，35天表達迅速升

5、高，之后表達量逐步升高，直至出生后140天，RANTES在附睪的表達仍然保持較高水平。
　　3.間接免疫熒光顯示RANTES結(jié)合于附睪正常精子的尾部中段，異常精子的頭部和尾部中段。流式細胞術(shù)顯示，隨著精子在附睪內(nèi)的轉(zhuǎn)運，RANTES與精子的結(jié)合率逐漸降低。
　　結(jié)論：
　　1.RANTES表達于人輸出小管與附睪管的上皮細胞，可能參與附睪管腔內(nèi)微環(huán)境的調(diào)節(jié)。
　　2.RANTES在小鼠發(fā)育過程中的變化提示，RANT