腫瘤微環(huán)境中趨化因子的表達和功能調(diào)節(jié).pdf

1、研究目的: 調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中多種細胞來源的多種趨化因子的表達和功能。 第一章:研究用siMAML1阻斷黑色素瘤細胞中Notch信號傳遞途徑，誘導(dǎo)依賴于TweakR上調(diào)的CCL2的表達，引導(dǎo)更多免疫細胞動員入侵腫瘤微環(huán)境。 第二章:探索血清溶血磷脂酸調(diào)節(jié)巨噬細胞/MoDC中CXCL16的生產(chǎn)和脫落的機理，了解LPA調(diào)節(jié)巨噬細胞對效應(yīng)T細胞的趨化活性及其與Gi/o，Rho和NFkB通路的關(guān)系，探討通過調(diào)節(jié)CXCL16

2、以增加腫瘤局部免疫效應(yīng)細胞的可行性。 第三章:觀察來自單核細胞的不同分化階段的MoDC產(chǎn)生的趨化因子表達水平，探討調(diào)節(jié)CCL22和CCL17在細胞中轉(zhuǎn)錄表達的機制與信號傳遞途徑，探索應(yīng)用DC腫瘤疫苗治療腫瘤時，特異性阻斷CCL22和CCL17的表達與功能，減少Treg的趨化移動頻率，同時吸引更多的T效應(yīng)細胞到腫瘤部位去殺傷腫瘤細胞。 研究方法: 第一章、 SiMAML1通過上調(diào)黑色素瘤細胞TweakR的表達誘導(dǎo)C

3、CL2的產(chǎn)生 1.用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測siMAML1，siHey1轉(zhuǎn)染對靶基因的抑制效果，及Tweak，TreakR和多種其他趨化因子基因的表達。 2.用Western-blot檢測以上分子相關(guān)蛋白的表達水平。 3.用流式細胞術(shù)分析TweakR在細胞表面的表達。 4.用酶聯(lián)免疫吸附試驗測量CCL2在細胞培養(yǎng)上清中的表達水平。 5.用單核細胞趨化實驗檢測黑色素瘤細胞分泌趨化因子對單核細胞的趨化

4、功能。 第二章、 LPA提高LPS刺激巨噬細胞產(chǎn)生CXCL16及調(diào)節(jié)細胞移動功能的研究 1.用流式細胞術(shù)分析LPA受體及趨化因子CXCL16在巨噬細胞，MoDC和單核細胞表面的表達。 2.定性RT-PCR檢測LPA受體基因在巨噬細胞，MoDC和單核細胞中的表達。 3.用酶聯(lián)免疫吸附試驗測量CXCL16在細胞培養(yǎng)上清中的表達水平。 4.用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測LPA/LPS對CXCL16基因表達的

5、調(diào)節(jié)作用。 5.用趨化實驗檢測巨噬細胞，MoDC和單核細胞分泌趨化因子對T細胞的趨化功能。 第三章、在DC細胞分化和成熟過程中通過siRNA特異性抑制CCL22和CCL17的表達影響T淋巴細胞亞群的動員 1.用流式細胞術(shù)分析CD11c，CD11b，CD14在MoDC，巨噬細胞和單核細胞表面的表達，及趨化因子受體CCR1，CCR2，CCR4，CCR8，CXCR3，CXCR6在CD4/CD8 T細胞表面的表達。

6、 2.用趨化因子蛋白芯片分析MoDC，巨噬細胞和單核細胞培養(yǎng)上清中趨化因子的廣泛表達。 3.用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測CCL22，CCL17，CCL2基因在巨噬細胞，MoDC和單核細胞中的表達及siCCL22，siCCL17對其調(diào)節(jié)作用。 4.用酶聯(lián)免疫吸附試驗測量CCL22，CCL17，CCL2在細胞培養(yǎng)上清中的表達水平。 5.用體外趨化實驗檢測siCCL22/siCCL17轉(zhuǎn)染的MoDC對CD4/CD8 T

7、細胞及Treg的趨化功能。 6.建立人乳腺癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，體內(nèi)檢測siCCL22/siCCL17轉(zhuǎn)染的MoDC對CD4/CD8 T細胞的趨化功能。 研究結(jié)果： 第一章、 SiMAML1通過上調(diào)黑色素瘤細胞TweakR的表達誘導(dǎo)CCL2的產(chǎn)生 1.SiMAML1增加TWeakR和CCL2的基因表達和蛋白生產(chǎn)SiMAML1成功轉(zhuǎn)染黑色素瘤細胞系M624后，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)顯示：與對照siRNA相

8、比，siMAML1幾乎完全抑制了MAML1 mRNA的轉(zhuǎn)錄。 2.外源性Tweak刺激CCL2的生產(chǎn)外源性Tweak劑量和時間依賴性地刺激黑色素瘤細胞系M624和siMAML1轉(zhuǎn)染后的黑色素瘤細胞系M624 CCL2的生產(chǎn)，應(yīng)用anti-TweakR封閉抗體阻斷Tweak-TweakR，卻幾乎完全抑制了外源性Tweak對CCL2的誘導(dǎo)產(chǎn)生，證明Tweak刺激CCL2生產(chǎn)需要Tweak-TweakR的交連。 3.SiMAM

9、L1增加依賴于CCL2的單核細胞遷移趨化實驗進一步研究M624生產(chǎn)的CCL2的功能發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siMAML1轉(zhuǎn)染的M624細胞，其培養(yǎng)上清對單核細胞的趨化能力顯著增強。 第二章、 LPA提高LPS刺激巨噬細胞產(chǎn)生CXCL16及調(diào)節(jié)細胞移動功能的研究 1.巨噬細胞和MoDC細胞表面表達LPA受體流式細胞術(shù)分析顯示巨噬細胞和MoDC細胞表面表達LPA受體1和LPA受體2，但沒有LPA受體3。 2.巨噬細胞和MoDC細胞表

10、面表達CXCL16流式細胞術(shù)分析顯示巨噬細胞和MoDC細胞表面表達CXCL16，少數(shù)單核細胞表面表達CXCL16。 3.LPA增加巨噬細胞中CXCL16的生產(chǎn)和脫落用LPS刺激巨噬細胞以誘導(dǎo)趨化因子的釋放，ELISA法檢發(fā)現(xiàn)，LPA大大增加CXCL16在巨噬細胞的生產(chǎn)和釋放。 4.LPA刺激巨噬細胞CXCL16脫落的信號傳遞途徑作為特定的Gi/o受體蛋白，Rho及NFkB通路抑制劑，ELISA分析顯示PTx，exoC3，

11、PDTC均能顯著降低LPA刺激誘導(dǎo)的CXCL16蛋白的生產(chǎn)，這表明LPA刺激誘導(dǎo)的CXCL16蛋白的生產(chǎn)需要Gi/o，Rho，NFkB通路的活化。 5.LPA增加巨噬細胞的趨化活性趨化實驗結(jié)果顯示，經(jīng)LPA/LPS刺激的巨噬細胞培養(yǎng)上清對CD3+T細胞的趨化能力顯著增強。 第三章、在MoDC細胞分化和成熟過程中通過siRNA特異性抑制CCL22和CCL17的表達影響T淋巴細胞亞群的動員 1.MoDC表達的趨化因子

12、與單核細胞不同由PBMC純化的CD14+細胞在培養(yǎng)基中單獨培養(yǎng)，獲得的細胞具有不同細胞的典型形態(tài)。 2.MoDC和單核細胞分泌的趨化因子對活化的T淋巴細胞的趨化能力不同MoDC的培養(yǎng)上清對CD4+和CD8+效應(yīng)淋巴細胞的趨化能力顯著高于單核細胞，但對靜止細胞的趨化能力相對較小。 3.抗體阻斷CCL22和CCL17能調(diào)節(jié)MoDC動員CD4+/CD8+比率和Treg的頻率將MoDC與抗-CCL2，抗-CCL17，anti-C

13、CL22，anti-CCL23，或相應(yīng)非特異抗體對照作用后，趨化實驗分析發(fā)現(xiàn)：阻斷CCL2對CD4+/CD8+ Treg的移動頻率幾乎沒有影響，但是阻斷CCL17和CCL22顯著地降低CD4+/CD8+比率和Treg的移動頻率。 4.用siRNA特異性的抑制CCL22和CCL17的表達可以調(diào)節(jié)CD4+/CD8+比率和MoDC動員Treg的頻率應(yīng)用CCL17和CCL22特異性siRNA轉(zhuǎn)染后沉默了CCL17和CCL22基因和蛋白的

14、表達，體外趨化實驗分析發(fā)現(xiàn)其結(jié)果顯著地降低CD4+/CD8+比率和Treg的移動頻率。 5.體內(nèi)瘤內(nèi)注射siCCL22和siCCL17轉(zhuǎn)染的MoDC招募更少Tregs但更多CD8+T細胞當人類乳腺癌細胞株于裸鼠長成實體瘤時，對照MoDC或經(jīng)siCCL22和siCCL17轉(zhuǎn)染的MoDC被注入腫瘤體內(nèi)后，實時定量熒光RT-PCR和ELISA法證實，在這些siRNA轉(zhuǎn)染的MoDC中，瘤體內(nèi)5-7天內(nèi)CCL22和CCL17幾乎被完全抑制

15、了，體外篩選的Tregs和激活CD8+T細胞混合液也被注入腫瘤體內(nèi)。 結(jié)論： 1. SiMAML1通過上調(diào)黑色素瘤細胞TweakR的表達誘導(dǎo)CCL2的產(chǎn)生Notch信號傳遞途徑在黑色素細胞中的高表達和天然活化，導(dǎo)致其下游轉(zhuǎn)錄抑制因子Heyl的轉(zhuǎn)錄和激活，后者抑制TweakR在細胞表面的表達而抑制CCL2的表達和分泌，因此降低免疫細胞在黑色素瘤腫瘤微環(huán)境的正常入侵和免疫監(jiān)視，表明Notch信號傳遞途徑代表腫瘤細胞擺脫自然免

16、疫監(jiān)視分子機制之一。siMAML1特異性阻斷Notch信號傳遞途徑下游的轉(zhuǎn)錄信號，增加TweakR表達，擴增了Tweak-TweakR之間的相互作用，誘導(dǎo)CCL2表達和自然免疫細胞的浸潤。因此，針對Notch信號傳遞途徑的siMAML1應(yīng)作為一種探索治療腫瘤的免疫治療策略。 2.LPA提高LPS刺激巨噬細胞產(chǎn)生CXCL16及調(diào)節(jié)細胞移動功能的研究LPA顯著地增加巨噬細胞經(jīng)LPS刺激產(chǎn)生的CXCL16。經(jīng)LPA處理后，巨噬細胞/M

17、oDC分泌產(chǎn)生的可溶性CXCL16對活化T細胞也具化學吸附能力。LPA不僅能增加其他炎性細胞因子的產(chǎn)生和脫落，也增加CXCL16的產(chǎn)生和脫落，進而引導(dǎo)更多的活化T細胞到炎癥和腫瘤局部，發(fā)揮功能性免疫反應(yīng)。因而LPA上調(diào)巨噬細胞和MoDC表達CXCL16，最有可能趨化誘導(dǎo)炎癥和腫瘤部位的Th1和功能性細胞毒性效應(yīng)。LPA和趨化因子之間的有機聯(lián)系會促進我們對脂質(zhì)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的認識。 3.在DC細胞分化和成熟過程中通過siRNA特異