內(nèi)源性BMSCs在骨修復(fù)中的作用及微環(huán)境相關(guān)趨化因子的表達(dá).pdf

1、目的： (1)分離、培養(yǎng)及鑒定攜帶綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)基因的骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)； (2)對內(nèi)源性BMSCs進(jìn)行示蹤及在骨修復(fù)中的作用進(jìn)行評估； (3)檢測骨折后1d，3d，5d，7d，14d，21d骨折微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived f

2、actot-1，SDF-1)、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)、肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)、間質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteina

3、se-9，MMP-9)的蛋白表達(dá)水平，篩選出表達(dá)量高且與BMSCs趨化規(guī)律相關(guān)的因子。 方法： (1)經(jīng)密度離心法從GFP轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠骨髓內(nèi)分離培養(yǎng)BMSCs。并通過向成骨樣細(xì)胞、脂肪樣細(xì)胞分化證明其具有多向分化能力，利用流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44和CD34的表達(dá)。 (2)4周齡普通雌性C57BL/6小鼠用10Gy的X線照射后，將攜帶GFP的BMSCs與普通C57BL/6小鼠的骨髓非貼壁細(xì)

4、胞制成混合細(xì)胞懸液后從其尾靜脈內(nèi)注入，建立嵌合體動物模型。 (3)利用嵌合體動物模型制造脛骨骨折模型，在不同時(shí)相點(diǎn)檢測骨折部位組織GFP陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例、來源于BMSCs的成骨細(xì)胞占全部成骨細(xì)胞的比例，判斷來源于骨髓的BMSCs在骨折修復(fù)中的作用；利用免疫組化等方法檢測骨折部位不同時(shí)相點(diǎn)SDF-1、CSF、HGF、G-CSF、MCP-1等趨化因子的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： (1)分離培養(yǎng)的BMSCs呈克隆樣

5、生長且呈GFP陽性；經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后出現(xiàn)鈣沉積；經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)后形成脂肪滴； (2)骨折局部GFP陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞比例在術(shù)后ld、5d、14d分別為3.011±0.911％、9.031±0.145％、12.064±0.145％；來源于BMSCs的成骨細(xì)胞占全部成骨細(xì)胞的50％以上； (3)骨折后各時(shí)相點(diǎn)微環(huán)境中SDF-1、CSF、HGF、MCP-1、MMP-9有不同程度的表達(dá)，G-CSF無明顯表達(dá)。SDF-1的表達(dá)量相對