BMSCs在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用.pdf

1、皮膚是人體面積最大的器官,也是機體自我更新速度最快的組織之一,它是機體免于脫水、損傷、感染的第一道防線,是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和阻止微生物、化學物質(zhì)等侵入的屏障。盡早覆蓋創(chuàng)面,恢復(fù)皮膚的屏障功能,十分重要。常規(guī)的治療方法采用自體皮膚或同種異體、異種皮膚的移植和人工替代物覆蓋等,由于存在著供皮來源有限,同種異體、異種皮肽移植有免疫排斥反應(yīng)或傳染疾病的危險,人工皮膚費用昂貴等問題,常規(guī)方法難以滿足臨床應(yīng)用的需要。因此,促進皮膚創(chuàng)傷修復(fù)已成為組織修

2、復(fù)領(lǐng)域亟待解決的難題之一,研究皮膚創(chuàng)傷愈合修復(fù)具有重要的理論和實際意義。
　　 成體干細胞(adult stem cells,ASCs)是一類具有多向分化潛能的細胞群體,因其存在于各種組織及器官中,來源廣泛,不涉及倫理問題,在臨床救治中具有廣泛的應(yīng)用前景,已成為近年醫(yī)學研究和應(yīng)用的熱點之一。目前,ASCs已經(jīng)從大多數(shù)組織中被分離和鑒定,并且能夠誘導(dǎo)分化為同一胚層或者不同胚層的細胞類型,顯示了其多向分化的潛能。很多研究表明,將AS

3、Cs特別是骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow-derivedmesenchymal stem cells,BMSCs)應(yīng)用于組織損傷修復(fù),取得很好的效果。
　　 創(chuàng)傷形成的創(chuàng)面從根本上說是組織缺損,而干細胞獨特的多向分化潛能、自我更新能力和增殖分化能力強的重要特性,正好滿足皮膚修復(fù)的需要。大量實驗研究發(fā)現(xiàn),BMSCs在體內(nèi)、體外可以分化為表皮細胞、成纖維細胞以及血管內(nèi)皮細胞,這都為干細胞治療皮膚創(chuàng)傷后缺損提供了理論支持。<

4、br>　　 因此,針對皮膚創(chuàng)傷修復(fù),本研究將BMSCs引入皮膚創(chuàng)傷后的創(chuàng)面治療,圍繞干細胞在創(chuàng)傷部位募集這一主題,明確BMSCs可以通過動員、募集作用參與創(chuàng)傷后組織修復(fù),進一步作深入細致的研究,并初步探討干細胞在創(chuàng)傷部位募集的機制,為臨床治療各種皮膚缺損提供了新的治療思路。
　　 本研究首先對小鼠的BMSCs進行分離、培養(yǎng),并對其進行誘導(dǎo)分化、鑒定,在此基礎(chǔ)上觀察了移植的BMSCs在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中募集現(xiàn)象,重點明確移植的B

5、MSCs可以向創(chuàng)面募集,促進皮膚創(chuàng)傷的修復(fù);同時,我們進一步探討了其可能的機制,根據(jù)已知的趨化原理,采用基因轉(zhuǎn)染的方法修飾BMSCs,促進BMSCs向創(chuàng)面的遷移,增加BMSCs向創(chuàng)面募集的數(shù)量,進一步提高BMSCs修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的效果。
　　 主要結(jié)果和結(jié)論:
　　 1.本實驗采用全骨髓貼壁法分離純化BALB/C雄性小鼠的BMSCs,體外培養(yǎng)可大量擴增和傳代,獲得了體外培養(yǎng)擴增BMSCs的簡單、穩(wěn)定、高效的方法;通過實驗鑒

6、定及觀察,BMSCs體外具有成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化的潛能,已經(jīng)符合種子細胞的基本條件,無論其“質(zhì)和量”均能夠滿足進一步研究和應(yīng)用的需要。
　　 2.本實驗中采用Co60全身照射(照射劑量3.5Gy),使骨髓產(chǎn)生放射性損傷以造成受體骨髓滅活,為移植的BMSCs留出空間,減少了動物自體骨髓干細胞的影響,移植培養(yǎng)的BMSCs后,成功建立骨髓移植嵌合體模型,以模擬自體BMSCs的作用,滿足實驗需求。本實驗骨髓移植嵌合體皮膚創(chuàng)傷動物模型的成

7、功建立,為各種免疫功能不同小鼠放創(chuàng)復(fù)合傷模型建立提供了參考。
　　 3.本實驗中,利用了三種不同細胞標記方式:CFDA-SE熒光標記、Y染色體標記、攜帶GFP基因的病毒載體轉(zhuǎn)染標記BMSCs,通過給受體雌性BALB/C小鼠尾靜脈注射來源于供體雄性BALB/C小鼠的標記BMSCs,分別利用組織切片后普通熒光顯微鏡觀察,定量Real-timePCR檢測創(chuàng)面組織中Y染色體的表達,以及冰凍切片后DAPI復(fù)染激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果顯示

8、,無論從直觀的現(xiàn)象觀察,還是從創(chuàng)面組織Y染色體檢測,都清楚地證實了BMSCs可以募集到創(chuàng)面,并參與了皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)。
　　 4.創(chuàng)傷后免疫功能正常的BALB/C鼠創(chuàng)面的愈合時間為14.00±1.41d,而免疫功能缺陷的裸鼠、SCID鼠創(chuàng)面的愈合時間分別為17.16±1.17d和19.83±0.76d,與BALB/C鼠比較存在顯著差異(P＜0.01)。
　　 5.本實驗通過RT-PCR檢測創(chuàng)面組織中SDF-1的基因表達發(fā)現(xiàn)

9、,創(chuàng)面愈合過程中BALB/C鼠SDF-1基因表達于傷后1d即有增高,5d達峰值(P＜0.01),然后逐漸下降,但仍明顯高于對照組,14d創(chuàng)面基本愈合時接近對照組。而裸鼠、SCID鼠創(chuàng)面中SDF-1基因表達于傷后逐漸增高,所測時相點中傷后7d達峰值(P＜0.01),與BALB/C鼠相比,SDF-1基因表達峰值延后,然后逐漸下降,14d創(chuàng)面未愈合時,SDF-1基因表達仍高于對照組。本研究結(jié)果表明,SDF-1既是調(diào)節(jié)局部炎癥的重要趨化因子,也

10、是調(diào)節(jié)組織器官損傷修復(fù)的關(guān)鍵細胞因子。正常皮膚基礎(chǔ)性表達SDF-1;創(chuàng)傷后,創(chuàng)面SDF-1表達增加,BMSCs募集到達創(chuàng)面,參與修復(fù)。另外機體的免疫功能也將影響B(tài)MSCs募集,從而影響創(chuàng)面愈合。這為臨床上治療各種創(chuàng)面,加速創(chuàng)面的盡早愈合提供了新的研究思路和方法。
　　 6.本實驗成功地構(gòu)建了CXCR4的腺病毒表達載體Adv-CXCR4,并轉(zhuǎn)染BMSCs,尾靜脈回輸BMSCs檢測創(chuàng)面組織中Y染色體的表達,結(jié)果顯示:無論未轉(zhuǎn)染Adv

11、-CXCR4的BMSCs還是Adv-CXCR4轉(zhuǎn)染的BMSCs移植,傷后1d,創(chuàng)面即檢測到Y(jié)染色體,最高峰出現(xiàn)在傷后5d,持續(xù)明顯表達14d以上;與未轉(zhuǎn)染Adv-CXCR4的BMSCs相比,Adv-CXCR4轉(zhuǎn)染的BMSCs移植后能更多地分布于BALB/C鼠的創(chuàng)面,二者相差顯著(P＜0.01)。同時,將Adv-CXCR4轉(zhuǎn)染的BMSCs移植到BALB/C鼠的體內(nèi)后,其創(chuàng)面平均愈合時間為12.46±1.17d,較移植未轉(zhuǎn)染Adv-CXCR