毛囊干細胞合成的β-NGF及受體p75NTR在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)早期作用的初步研究.pdf

1、毛囊是一個由上皮細胞、神經(jīng)末梢和間質(zhì)細胞相互作用形成的單位[74]，其發(fā)生和維持涉及到來自不同胚層的二十多種不同種類的細胞亞群，結(jié)構(gòu)和功能非常復(fù)雜。這些細胞在內(nèi)根鞘(IRS)、外根鞘(ORS)、毛干(HS)和真皮乳頭(DP)中棲息生長，因此發(fā)育生物學(xué)認為毛囊是上皮和間充質(zhì)相互作用的一個極有意義的研究模型[14]。 根據(jù)毛囊的發(fā)育和生長可將毛囊循環(huán)周期分為四個階段，即生長期(anagen)、退化期(catagen)、靜止期(tel

2、ogen)和一個推測的活躍脫毛期(exogen)[17,36]。在生長早期，毛囊下端的上皮細胞和內(nèi)含的間充質(zhì)真皮乳頭(dermalpapillae，DP)呈球狀向下生長到達真皮，KC(keratinocyte，KC)迅速增殖分化形成毛囊的各細胞群；退化期中，KC突然停止增殖并開始退化，DP內(nèi)以及周圍的細胞外基質(zhì)降解，DP濃縮、上升并緊鄰毛囊永久部分的隆突部(bulge)。隨后，毛囊進入相對不活動的靜止期。毛囊周期依此周而復(fù)始。在毛囊周期

3、循環(huán)過程中，不僅毛囊形態(tài)發(fā)生了很大的變化，而且每一階段的發(fā)育和生長都受到多種信號和因子調(diào)節(jié)。 Cotsarelis等采用連續(xù)3H標記發(fā)現(xiàn)小鼠皮膚、睫毛、觸須的毛囊球部并未見標記細胞及干細胞特征，但可見于隆突區(qū)，而利用脈沖3H標記則發(fā)現(xiàn)標記物位于毛母質(zhì)，卻未見于隆突區(qū)，于是提出“隆突激活假說”(bulge-activationhypothesis)[6]。不久前Rochat等研究人類毛囊KC增殖能力時發(fā)現(xiàn)位于毛囊上部分隆突區(qū)分離細

4、胞的克隆性生長能力要遠大于其他部位分離的細胞[15]。2000年Taylor等采用Brdu和3H雙標記方法同樣證實HFSC定位于毛囊上段隆突區(qū)[1]。當前研究認為，這所謂的隆突區(qū)即是HFSC的棲所[7，8]。在2004年，幾個實驗室相繼闡述在體HFSC特性以及分類，為HFSC的研究奠定了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)[9,10,11]。這些研究表明毛囊隆突區(qū)存在一些具有未分化特性、慢周期性并具有較強體外增殖能力的干細胞。Morris等研究發(fā)現(xiàn)K15

5、啟動子在成人的毛囊隆突區(qū)細胞中具有特異活性[12]，于是利用K15轉(zhuǎn)基因鼠來標記并利用細胞分離技術(shù)分離毛囊隆突區(qū)細胞和子代細胞。這些細胞能夠在正常毛囊周期中形成新生毛囊的所有上皮層。這些細胞由一些特定的基因表達控制，而這些基因表達也常見于其他種類干細胞中[9]。同樣，Tumbar等也發(fā)現(xiàn)隆突區(qū)細胞駐留在干細胞微環(huán)境的巢時保持未分化狀態(tài)而一旦脫離干細胞巢或受到外界刺激時則改變干細胞的特性[10]。在2004年，Sieber-Blum等人發(fā)

6、現(xiàn)毛囊中隆突區(qū)存在兩種神經(jīng)嵴來源細胞，即多潛能干細胞和神經(jīng)纖維末梢觸覺細胞(Merkel細胞)[32，33]。在體外研究發(fā)現(xiàn)，這些多潛能的干細胞能夠分化為神經(jīng)元、許旺細胞、平滑肌細胞、色素細胞、軟骨細胞和其他種類的細胞。這些結(jié)果突破了以往認為HFSC只能定向分化為皮膚細胞的范疇。以上證據(jù)說明毛囊隆突區(qū)細胞具有慢周期性并具有強大增殖潛能，為一種成體干細胞。 多種細胞參與皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程。在創(chuàng)傷后幾小時，表皮細胞開始增殖并遷移以覆蓋

7、暴露的傷口進行再上皮化修復(fù)，大量的細胞因子參與愈合過程，NGF由成纖維細胞、KC和肥大細胞等駐留細胞產(chǎn)生，起重要的生理作用。早在1987年Weskamp與Otten發(fā)現(xiàn)皮膚含有豐富的NGF[18]，隨后進一步研究發(fā)現(xiàn)皮膚中不僅表達NGF而且還存在其受體[19]。Paus等通過進行哺乳動物皮膚器官培養(yǎng)首次證明NGF能夠在原位調(diào)節(jié)正常表皮KC的增殖[20]。NGF通過兩種細胞表面受體調(diào)節(jié)靶細胞活動，即低親和性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75NTR)

8、和高親和性TrkA受體[22]，刺激培養(yǎng)狀態(tài)下人類表皮KC增殖并且抑制其凋亡[21]。局部應(yīng)用NGF能夠加速正常和糖尿病小鼠的表皮創(chuàng)傷愈合率，[23]。皮膚未損傷時血清中不能探測到NGF，而當全層損傷后血清中NGF水平會迅速增高。損傷后1天，損傷皮膚NGF水平達到頂峰，在14天時回歸到基準值。原位雜交顯示mRNANGF位于創(chuàng)傷部位的表皮細胞、成纖維細胞和肉芽組織中。損傷后原位駐留細胞合成的NGF由各種炎癥因子調(diào)節(jié)。NGF具有一種對皮膚成

9、纖維細胞產(chǎn)生趨化作用的活性，刺激這些細胞在體外創(chuàng)傷模型中遷移但不影響其增殖、膠原合成和MMP活性[24]。通過添加NGF并進行長時間培養(yǎng)，成纖維細胞能夠表達p75NTR，介導(dǎo)細胞凋亡信號。這表明NGF可作用創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)晚期階段的成纖維細胞凋亡[24]。 我們通過五方面的實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1.HFSC與β-NGF的表達關(guān)系 首先成功地進行了體外分離、培養(yǎng)和鑒定HFSC。DMEM/F12培養(yǎng)基適合細胞生長但是

10、其維持細胞未分化狀態(tài)方面不如KSFM。培養(yǎng)的原代細胞在第5、6d時數(shù)量和形態(tài)達到相對較好狀態(tài)，超過6d細胞的形態(tài)發(fā)生改變而數(shù)量緩慢增加。在較好狀態(tài)時細胞形態(tài)均一，呈鋪路石狀以毛囊隆突區(qū)為中心放射性生長，可見有絲分裂相。透射電鏡結(jié)果顯示細胞核大，核漿比相對于一般分化細胞大，表現(xiàn)出原始細胞形態(tài)特征。免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示胞漿表達β-NGF、p75NTR、K15、CD34和β1-integrin。原位雜交顯示mRNAβ-NGF探針標記的mRNA

11、位于核膜周圍。圍繞胞核分散放射狀。HFSC分泌的β-NGF在早期(1～4d)呈逐漸上升趨勢，在第5d達到最高值，隨后下降，但是下降趨勢比早期的上升趨勢較緩和。統(tǒng)計分析結(jié)果表明HFSC分泌的β-NGF與非增殖的原代組織分泌的β-NGF在前6d有非常顯著的差別(p＜0.01)，而在第7、8d時有顯著差別(p＜0.05)。 2.胚胎期大鼠唇部毛囊β-NGF、p75NTR、K15、CD34和β1-integrin的表達以及作用

12、在胚胎期大鼠的E15時期，觸須毛囊剛開始發(fā)育，僅可見一細胞團。隨著時間的推移，毛囊外部形態(tài)開始顯現(xiàn)。到E19時可見完整毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)。相應(yīng)因子根據(jù)毛囊發(fā)育的進行而變化，大體變化趨勢如圖2-1所示。 β-NGF在E15表達量較高，E17.5表達量最低。整個過程呈現(xiàn)先高后低，然后再升高的趨勢。 β1-integrin則呈現(xiàn)穩(wěn)步增高的表達，即在E15表達最低，在E19表達最高。 p75NTR呈現(xiàn)整體降低趨勢。在E19達到

13、最低，E15最高。 CD34為穩(wěn)定升高趨勢，E15表達最低而E19表達最高。 K15則為穩(wěn)定升高趨勢，E15表達最低，E17.5和E19表達最高。 3.胚胎期大鼠背部表皮基底層β-NGF、p75NTR、K15、CD34和β1-integrin的表達以及作用 在對胚胎期大鼠背部皮膚研究過程中，可見皮膚的發(fā)育呈逐漸增厚的趨勢。早在E15時期，大鼠的背皮非常單薄，容易與皮下組織脫離。不可見皮膚中背皮毛囊。而到E

14、19時期，皮膚結(jié)構(gòu)相對緊湊，層次也較鮮明。在表皮下方可見小細胞群落樣結(jié)構(gòu)，可能為背皮毛囊細胞。 β-NGF在E15表達量較高，E17.5表達量最低。整個過程為呈現(xiàn)先高后低，然后再升高趨勢。但是其表達的變化較觸須毛囊弱。 β1-integrin則呈現(xiàn)先高后低表達。在E16表達最高，隨后表達降低，在E19時表達最低。 p75NTR呈現(xiàn)整體降低然后穩(wěn)定的趨勢。在E15達到最高，之后平穩(wěn)表達。 CD34為波浪式變

15、化，E15表達最低而E16表達最高。 K15則為先高后低趨勢，E16表達最低，E19表達最高，但是與E15相差不明顯，其趨勢與β1-integrin相反。 4.表皮全層損傷后毛囊隆突區(qū)的β-NGF、p75NTR、K15、CD34和β1-integrin的變化 表皮全層切除對機體造成外界刺激因素，機體迅速對其做出反應(yīng)，修復(fù)創(chuàng)傷，促進愈合。對照組為正常組織切片。 全層表皮創(chuàng)傷后β-NGF與對照組相比在48h變

16、化顯著； β1-integrin與對照組相比在18h變化顯著； p75NTR與對照組相比在4h、48h、72h、96h和120h變化顯著； CD34與對照組相比在24h、72h、120h變化顯著； K15與對照組相比在6h、12h、24h、36h、48h、120h變化顯著。 5.體外表皮細胞創(chuàng)傷模型對HFSC影響 體外表皮細胞創(chuàng)傷模型中創(chuàng)傷前后培養(yǎng)基中β-NGF含量有非常顯著的差別(p＜0

17、.01)。這提示β-NGF在創(chuàng)傷愈合過程中具有非常重要的生理作用。加入條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞形態(tài)發(fā)生了很大的改變，即由未加條件培養(yǎng)基的小而圓、鋪路石狀轉(zhuǎn)變?yōu)殚L而多分支狀，細胞內(nèi)容物增多，鏡下觀察呈顆粒狀。細胞生長以及增殖能力下降。Neurofilament200染色顯示細胞已分化為類似神經(jīng)元的細胞。CD34呈微弱陽性，β1-integrin及K15表達呈陰性，提示干細胞已經(jīng)分化。而未加入條件培養(yǎng)基的正常培養(yǎng)細胞則不分化，生長情況如摘要結(jié)果