外周血來源的成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)鑒定以及在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、除了骨髓組織，成人外周血中也存在著如造血干細(xì)胞（HSCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)等多潛能干細(xì)胞成分。相對于骨髓的采集，外周血的干細(xì)胞采集具有供體創(chuàng)傷小、來源廣泛和自體取材無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點。近年來，循環(huán)間充質(zhì)干細(xì)胞（PeripheralBloodMesenchymalStemCells，PBMSCs）和循環(huán)成纖維細(xì)胞（CirculatingFibrocytes，CF）這兩種新型的多潛能成體干細(xì)胞在人類以及其他哺乳動物外周血中被發(fā)現(xiàn)

2、并鑒定，它們在機(jī)體組織器官的正常和非正常功能活動和創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用。
　　本研究著眼于應(yīng)用成體干細(xì)胞分離技術(shù)，在體外分離培養(yǎng)外周血來源的成體干細(xì)胞—循環(huán)成纖維細(xì)胞，觀察它們在體內(nèi)和體外的細(xì)胞增殖、分化、以及與多種皮膚組織細(xì)胞的相互作用；從細(xì)胞因子調(diào)控等多方面研究其作用機(jī)理，并將其應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)過程，為組織工程皮膚的研究開辟了新的思路，更有助于提高組織工程皮膚產(chǎn)品的臨床應(yīng)用效果。
　　本研究主要分為四個部分

3、r>　　1.人外周血來源成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定
　　目的：通過多種方法分離人外周血單個核細(xì)胞，在不同條件下獲得CF，研究了其細(xì)胞增殖特點和對其進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定。方法：采用淋巴細(xì)胞分離液(Percoll/Ficoll)分離含有外周血單個核細(xì)胞的白細(xì)胞群，直接體外培養(yǎng)或磁珠分選法分離單個核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得CF細(xì)胞；通過不同細(xì)胞因子促進(jìn)CF細(xì)胞增殖，比較效果；培養(yǎng)過程中描畫CF細(xì)胞生長曲線；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和流式細(xì)胞儀對體

4、外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果：通過分離成人外周血單個核細(xì)胞的方法可以獲得純度較高的CF細(xì)胞；在培養(yǎng)過程中應(yīng)用M-csf和TPO兩種細(xì)胞因子可以促進(jìn)CF細(xì)胞的成熟和增殖；細(xì)胞生長曲線顯示經(jīng)過細(xì)胞因子的促進(jìn)作用，CF細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中增殖速度加快。其中合適濃度的TPO的促進(jìn)作用更為明顯且細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低，是理想的促進(jìn)CF細(xì)胞體外增殖的作用因子；免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果顯示，本實驗中體外培養(yǎng)獲得的貼壁纖維樣細(xì)胞表達(dá)CollagenⅠ且有Collage

5、nⅠ陽性的基質(zhì)分泌。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的細(xì)胞其表面標(biāo)志性抗原的表達(dá)隨著時間改變而不斷變化，但均符合CF細(xì)胞的特征。鑒定結(jié)果顯示獲得的細(xì)胞明確屬于CF細(xì)胞。
　　2.外周血來源成體干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的多向分化能力研究
　　目的：探討CF細(xì)胞作為一種多潛能成體干細(xì)胞其成骨、成脂和向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。方法：采用與雪旺細(xì)胞（Schwanncells，SCs）共培養(yǎng)以及直接添加細(xì)胞因子NGF的方法，促進(jìn)CF細(xì)胞向神經(jīng)

6、細(xì)胞分化，通過免疫組織化學(xué)、Westernblot以及RT-PCR等方法對誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定；以添加地塞米松（dexamethasone，100nM）；β磷酸甘油鈉（β-glycerophosphate，10mM）；維生素C/抗壞血酸（Ascorbicacid，50μM）等試劑的培養(yǎng)基對CF細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，通過大體形態(tài)和茜素紅染色鑒定誘導(dǎo)的細(xì)胞；以地塞米松（dexamethasone，1μM）、0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3

7、-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰島素（insulin，10μg/ml）、吲哚美辛（Indomethacin，100mM）等試劑為活性成分的成脂誘導(dǎo)液，對體外培養(yǎng)的CF細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，通過大體形態(tài)和油紅O染色鑒定誘導(dǎo)的細(xì)胞。結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示在兩種誘導(dǎo)條件下CF細(xì)胞均表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志物NSE和NF-H。westernblot和RT-PCR結(jié)果也顯示同樣的結(jié)果且共培養(yǎng)組的表達(dá)更強(qiáng)。成骨誘導(dǎo)結(jié)果細(xì)

8、胞茜素紅染色顯示陽性，顯示CF細(xì)胞在一定條件下具備成骨分化能力；油紅O染色結(jié)果顯示陽性說明CF細(xì)胞可以向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　3.體外觀察循環(huán)成纖維細(xì)胞對皮膚組織細(xì)胞的作用影響
　　目的：1）二維環(huán)境下通過共培養(yǎng)的方法觀察CF細(xì)胞對皮膚組織細(xì)胞的作用影響；2）三維條件下通過體外構(gòu)建復(fù)合CF細(xì)胞的組織工程人工皮膚，觀察CF細(xì)胞對皮膚組織細(xì)胞的作用影響。方法：1）以絲裂霉素C處理體外培養(yǎng)的原代CF細(xì)胞，使其成為類滋養(yǎng)層細(xì)胞；將體外

9、分離培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞（Fibroblasts，F(xiàn)Bs）和皮膚角阮細(xì)胞（Keratinocytes，KCs）與制備的類滋養(yǎng)層CF直接接觸共培養(yǎng)，通過直接光鏡觀察、MTT法、BrdU-ELISA摻入法、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期以及細(xì)胞運動（劃痕）實驗（Scratchassay）等手段觀察兩種皮膚組織細(xì)胞在體外的形態(tài)和增殖變化。2）體外構(gòu)建具有復(fù)合CF細(xì)胞的真皮層的組織工程人工皮膚，通過大體觀察，HE染色組織學(xué)觀察，Pan-CK免疫組織化學(xué)

10、染色等手段研究三維環(huán)境下CF細(xì)胞對皮膚組織細(xì)胞的作用影響。結(jié)果：1）絲裂霉素C處理后的CF細(xì)胞多次傳代后基本停止增殖，經(jīng)過與皮膚組織細(xì)胞的共培養(yǎng)后逐漸死亡；與類滋養(yǎng)層CF細(xì)胞共培養(yǎng)的FBs細(xì)胞形態(tài)基本沒有明顯變化，而KCs則形態(tài)變化明顯，出現(xiàn)表皮去分化特征性的細(xì)胞形態(tài)；MTT、BrdU-ELISA和流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期顯示共培養(yǎng)后的FBs增殖加快，而KCs則增值速度減慢，提示CF細(xì)胞促進(jìn)FBs的增殖作用和對KCs的抑制作用；細(xì)胞劃痕試

11、驗則顯示共培養(yǎng)后的FBs細(xì)胞移行能力加強(qiáng)，而KCs則呈現(xiàn)相反的趨勢。2）與具有單純復(fù)合成纖維細(xì)胞真皮的對照組相比，復(fù)合有CF細(xì)胞的真皮層的組織工程皮膚體外培養(yǎng)過程中體積收縮更為明顯，提示成纖維細(xì)胞增殖加速；但與正常對照組相比，其上皮化過程不良，角化層結(jié)構(gòu)較差。
　　4.循環(huán)成纖維細(xì)胞參與裸鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的實驗研究
　　目的：將體外分離培養(yǎng)獲得的人CF細(xì)胞通過循環(huán)途徑移植入裸鼠體內(nèi)，觀察其參與皮膚組織創(chuàng)傷修復(fù)的效果。方法：建立

12、裸鼠背部全層皮膚創(chuàng)傷模型；體外以PKH26熒光染料標(biāo)記體外培養(yǎng)的人CF細(xì)胞；鼠尾靜脈注射方法將標(biāo)記好的人CF細(xì)胞移植入裸鼠創(chuàng)傷模型體內(nèi)，設(shè)立空白對照；大體觀察創(chuàng)面愈合情況，測量各組創(chuàng)面面積計算創(chuàng)面收縮率，3w左右采用抗人單克隆抗體（Pan-CK，α-SMA，Ⅷ等）對創(chuàng)傷部位皮膚組織進(jìn)行取材免疫組織化學(xué)染色；定期取創(chuàng)面組織進(jìn)行HE染色組織學(xué)觀察，冰凍切片進(jìn)行熒光顯微鏡檢測PKH26陽性細(xì)胞。結(jié)果：實驗組和對照組裸鼠創(chuàng)傷皮膚均出現(xiàn)愈合，通過

13、大體觀察和計算創(chuàng)面收縮率結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組的創(chuàng)面愈合快于對照組；實驗組愈合創(chuàng)面的上皮化較對照組好，血管生成更豐富；實驗組和對照組在各時間段均未在創(chuàng)面區(qū)域組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)PKH26陽性的細(xì)胞；抗人單抗免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示實驗組創(chuàng)面區(qū)域在3w后各抗體均有表達(dá)，提示遷移至裸鼠皮膚創(chuàng)面參與修復(fù)的細(xì)胞可能來源于移植的人CF細(xì)胞。
　　綜上所述，CF細(xì)胞在體外來源廣泛，體外較易分離培養(yǎng)，通過某些細(xì)胞因子的作用可以有效促進(jìn)其增殖。CF細(xì)胞作為一種創(chuàng)傷