成體骨髓干細胞在腎小管上皮細胞再生及損傷修復中的作用.pdf

1、急性腎功能衰竭是多種不同原因引起的腎功能急劇下降的綜合征。在臨床實踐中，由于攝入有毒的物質或一些腎毒性藥物引起的急性腎小管損傷是導致急性腎功能衰竭(ARF)的常見原因。雖然許多藥物和生長因子已被證實對某些動物的ARF有效，但是近幾十年來，并沒有明顯有效的新治療方法在臨床上應用。 對成體干細胞的研究是近幾年的熱點，這類細胞具有多向分化潛能。研究發(fā)現(xiàn)成體骨髓干細胞(BMSC)不僅能分化為造血細胞，也能分化為多種非造血組織的細胞類型。

2、骨髓內的干細胞包括兩種：造血干細胞(HSCs)和間質干細胞(MSCs)。多項研究表明，HSCs和MSCs均具有多向分化潛能。其中，MSCs由于具有易于獲取、體外增殖能力強且性能穩(wěn)定、低免疫原性等特點，使其在再生醫(yī)學的應用中具有突出的優(yōu)勢。 本實驗利用骨髓移植和腎臟移植兩種模型，觀察骨髓中的干細胞和循環(huán)中的干細胞，在正常腎臟組織中，有無參與腎小管上皮細胞的更新、再生，進而為成體骨髓干細胞在腎臟疾病中的應用奠定基礎。鑒于MSCs的臨

3、床應用潛能，我們觀察了MSCs對氯化汞導致的大鼠急性腎小管損傷有無治療作用，并探討了其腎臟保護作用的可能機制。 第一章成體骨髓干細胞在腎小管上皮細胞再生中的作用 一、材料和方法 1．骨髓移植模型 選用18只體重200g左右雄性F344大白鼠，水合氯醛麻醉后，取其雙側股骨、脛骨，將骨的兩端剪開，用5ml注射器吸取2ml生理鹽水，反復幾次沖出骨髓腔中的細胞，細胞接著通過200目的鋼絲網(wǎng)，制成單細胞懸液，計數(shù)，

4、每只雌鼠大約移植5×10<'7>個骨髓有核細胞，懸浮于0.5ml的生理鹽水中，尾靜脈注入全身經(jīng)C060-γ射線lOGray致死性照射的雌性大鼠中。在照射后6小時內注入骨髓細胞。2周(n=6)、8周(n=6)、14周(n=6)取腎臟標本。 2．腎臟移植模型 另選28只200—250g的F344大白鼠，雌雄各半。將雌鼠的左腎原位移植給雄鼠。2周(n=4)、8周(n=4)、14周(n=6)取移植腎臟標本。 3.HE

5、染色和激光顯微切割 腎臟石蠟組織塊切成8μM厚切片，撈片于裱有膜的切片上，進行常規(guī)HE染色。激光顯微切割在20×物鏡下，選擇腎小管上皮細胞切割，切割下來的細胞在重力作用下落至下方的0.2ml離心管蓋內，每個標本大約有2～3×10<'4>個細胞被切下。 4.DNA的提取和PCR反應 提取激光切割下來的細胞的DNA，用PCR方法檢測細胞中有無Sry基因。 二、結果 1．DNA的提取

6、 從激光切割下的細胞中提取的DNA的濃度大約是10—30μg／ml，吸光度260／280nm>1.80，體積大約為20-30μl。 2．Sry基因的檢測 在兩種模型8周、14周所取標本中，大部分可擴增出Sry基因特異性的條帶：而兩種模型2周的標本均未見Sry基因的存在。 三、小結 1．成體骨髓干細胞可能是腎小管上皮細胞再生的一個來源。 第二章骨髓間質干細胞對腎小管損傷的修復作用 一、材

7、料和方法 1．骨髓MSCs的原代培養(yǎng)及誘導分化 取Fischer 344雄性大鼠，6～8周齡，頸椎脫臼處死后，取骨髓細胞過程同前。用含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基懸浮骨髓細胞，繼而接種于25cm<'2>的塑料培養(yǎng)瓶中，密度為每瓶2×10<'7>個細胞，3天后更換培養(yǎng)液，貼壁細胞即為MSCs。待MSCs傳至第五代以后時，分別用成骨和成脂細胞誘導液誘導MSCs向成骨細胞和脂肪細胞分化，以確定它們的多向分化潛能。

8、 2．急性腎衰竭模型的建立及動物分組 大鼠急性腎衰竭模型的建立采用腹腔注射HgCl<,2>的方法，劑量為2mg／kg。SD雌性大鼠分為3組：MSCs組(HgCl<,2>／MSCs)，n=10，腹腔注射HgCl<,2> 4～6小時后，每只大鼠約輸注4×10<'6>個干細胞；Saline組(HgCl<,2>／Saline)，n=10，使用無菌生理鹽水代替治療組的MSCs。另取3只正常雌性大鼠作為正常對照組。細胞及生理鹽水均通

9、過尾靜脈輸注。7天后，取材進行分析。 3．組織學和腎臟病理損害的評分 腎組織石蠟切片2 μm厚，行HE和PAS染色。對腎小管損害程度采用百分比評分法進行評估，計算20個顯微鏡高倍視野(×400，HPF)腎皮質及外髓中發(fā)生損害(腎小管擴張、萎縮、管型、細胞脫落、壞死或小管炎)的腎小管數(shù)目和總腎小管數(shù)，以發(fā)生損害的腎小管數(shù)占總腎小管數(shù)的百分比表示，最后取20個視野的平均值作為每個標本最終的腎小管損害評分。 4．免

10、疫組織化學染色和半定量分析 腎組織石蠟切片行免疫組化染色。增殖細胞核抗原(PCNA)用小鼠抗人PCNA-抗體(與大鼠存在交叉反應)標記。每個標本分別計算腎皮質區(qū)及外髓區(qū)20個高倍視野，進行PCNA<'+>細胞的計數(shù)，求和后分別取其平均值作為最后數(shù)值。 5．統(tǒng)計學分析 組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，p(0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 二、結果 1.MSCs向脂肪細胞

11、和成骨細胞的分化 采用貼壁法分離的MSCs，是一個異質性群體，體外增殖能力強。MSCs用成脂誘導液誘導下，可見到明顯的含有大量脂滴的脂肪細胞形成，經(jīng)蘇丹Ⅲ染色，脂滴被染成桔紅色。在用成骨誘導液誘導時，可見大量的鈣結節(jié)形成，經(jīng)茜素紅染色，含鈣的結節(jié)被染成桔紅色。 2.MSCs治療改善ARF大鼠的生存狀況 腹腔注射HgCl<,2>后，大鼠的死亡主要集中在第5～7天。7天時，MSCs組的生存率明顯高于Salin

12、e組。在體重改變上，MSCs組略有增加，Saline組則明顯下降。 3．MSCs治療改善ARF大鼠的腎功能 腎功能的檢測結果顯示，MSCs組的Scr、BUN均明顯低于Saline組，但Scr仍高于正常大鼠。 3．MSCs治療促進腎小管上皮細胞損傷的修復 7天時，Saline組的皮質和外髓質許多小管仍可見到擴張、管型、細胞腫脹、炎癥細胞浸潤等病變的存在，而MSCs組則明顯減輕。 4．腎小管上

13、皮細胞PCNA表達情況 PCNA是增生細胞核抗原，腎小管損傷時PCNA表達增多，隨著腎功能的恢復，PCNA<'+>細胞數(shù)會逐漸減少。HgCl<,2>致急性腎小管損傷后7天，Saline組PCNA<'+>細胞數(shù)顯著高于MSCs組。@2三、小結 1．MSCs輸注可改善HgCl<,2>導致的急性腎衰竭大鼠的生存狀況及腎功能； 2．MSCs輸注可促進腎小管上皮細胞損傷的修復。 第三章骨髓間質干細胞促進腎小

14、管損傷修復的機制 一、材料和方法 1．EGFP質粒穩(wěn)定轉染MSCs 為了追蹤注入大鼠體內的MSCs，我們用pEGFP質粒轉染MSCs以作為標記。轉染后72小時，在培養(yǎng)基中加入G418 lmg/ml進行篩選。然后挑選表達GFP強的MSCs克隆進行擴增，用于移植。 2．免疫組織化學染色和半定量分析 腎組織石蠟切片行免疫組化染色。巨噬細胞用消鼠抗大鼠CD68單克隆抗體(ED-1)標記。每個標本分別計算

15、腎皮質區(qū)及外髓區(qū)20個高倍視野(×400)，進行EDl<'+>細胞的計數(shù)，求和后分別取其平均值作為最后數(shù)值。 3．RT-PCR 從新鮮冰凍組織中提取RNA，用RT-PCR的方法檢測TNF-a、IL-1β、MCP-1、EGF、HGF、PDGF，以GAPDH作為內參照，計算與內參照比值，以作為最終的數(shù)值。 4．統(tǒng)計學分析 組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

16、 二、結果 l.MSCs在腎臟的分布 7天時，在MSCs移植組大鼠的腎組織中，僅在腎間質偶爾可見GFP染色陽性的細胞，而在腎小球和腎小管處并沒有檢測到。 2．腎間質巨噬細胞浸潤的情況 ED-1是巨噬細胞的標志物，正常腎組織中巨噬細胞很少。急性腎功能衰竭時，浸潤的巨噬細胞增加，主要集中在腎小管間質損害顯著處。7天時，Saline組ED-1<'+>細胞數(shù)顯著高于MSCs組。 3．腎組織中細胞因子的表

17、達情況 急性腎小管損傷時，一些生長因子可以促進小管上皮細胞的修復，而一些炎癥因子的釋放則不利于細胞的修復。7天時，EGF、PDGF、HGF在MSCs組腎組織中的表達均明顯高于Saline組；促炎癥因子中，MSCs組的TNF-a明顯低于Saline組，而IL-1β和MCP-1雖比Saline組低，但差異無統(tǒng)計學意義。 結論 本研究發(fā)現(xiàn)成體骨髓干細胞可能是腎小管上皮細胞再生的一個來源。MSCs輸注可改善HgCl<,2