成體骨髓干細(xì)胞在腎小管上皮細(xì)胞再生及損傷修復(fù)中的作用.pdf

1、急性腎功能衰竭是多種不同原因引起的腎功能急劇下降的綜合征。在臨床實(shí)踐中，由于攝入有毒的物質(zhì)或一些腎毒性藥物引起的急性腎小管損傷是導(dǎo)致急性腎功能衰竭(ARF)的常見原因。雖然許多藥物和生長因子已被證實(shí)對某些動物的ARF有效，但是近幾十年來，并沒有明顯有效的新治療方法在臨床上應(yīng)用。 對成體干細(xì)胞的研究是近幾年的熱點(diǎn)，這類細(xì)胞具有多向分化潛能。研究發(fā)現(xiàn)成體骨髓干細(xì)胞(BMSC)不僅能分化為造血細(xì)胞，也能分化為多種非造血組織的細(xì)胞類型。

2、骨髓內(nèi)的干細(xì)胞包括兩種：造血干細(xì)胞(HSCs)和間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。多項(xiàng)研究表明，HSCs和MSCs均具有多向分化潛能。其中，MSCs由于具有易于獲取、體外增殖能力強(qiáng)且性能穩(wěn)定、低免疫原性等特點(diǎn)，使其在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用中具有突出的優(yōu)勢。 本實(shí)驗(yàn)利用骨髓移植和腎臟移植兩種模型，觀察骨髓中的干細(xì)胞和循環(huán)中的干細(xì)胞，在正常腎臟組織中，有無參與腎小管上皮細(xì)胞的更新、再生，進(jìn)而為成體骨髓干細(xì)胞在腎臟疾病中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。鑒于MSCs的臨

3、床應(yīng)用潛能，我們觀察了MSCs對氯化汞導(dǎo)致的大鼠急性腎小管損傷有無治療作用，并探討了其腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。 第一章成體骨髓干細(xì)胞在腎小管上皮細(xì)胞再生中的作用 一、材料和方法 1．骨髓移植模型 選用18只體重200g左右雄性F344大白鼠，水合氯醛麻醉后，取其雙側(cè)股骨、脛骨，將骨的兩端剪開，用5ml注射器吸取2ml生理鹽水，反復(fù)幾次沖出骨髓腔中的細(xì)胞，細(xì)胞接著通過200目的鋼絲網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，

4、每只雌鼠大約移植5×10<'7>個(gè)骨髓有核細(xì)胞，懸浮于0.5ml的生理鹽水中，尾靜脈注入全身經(jīng)C060-γ射線lOGray致死性照射的雌性大鼠中。在照射后6小時(shí)內(nèi)注入骨髓細(xì)胞。2周(n=6)、8周(n=6)、14周(n=6)取腎臟標(biāo)本。 2．腎臟移植模型 另選28只200—250g的F344大白鼠，雌雄各半。將雌鼠的左腎原位移植給雄鼠。2周(n=4)、8周(n=4)、14周(n=6)取移植腎臟標(biāo)本。 3.HE

5、染色和激光顯微切割 腎臟石蠟組織塊切成8μM厚切片，撈片于裱有膜的切片上，進(jìn)行常規(guī)HE染色。激光顯微切割在20×物鏡下，選擇腎小管上皮細(xì)胞切割，切割下來的細(xì)胞在重力作用下落至下方的0.2ml離心管蓋內(nèi)，每個(gè)標(biāo)本大約有2～3×10<'4>個(gè)細(xì)胞被切下。 4.DNA的提取和PCR反應(yīng) 提取激光切割下來的細(xì)胞的DNA，用PCR方法檢測細(xì)胞中有無Sry基因。 二、結(jié)果 1．DNA的提取

6、 從激光切割下的細(xì)胞中提取的DNA的濃度大約是10—30μg／ml，吸光度260／280nm>1.80，體積大約為20-30μl。 2．Sry基因的檢測 在兩種模型8周、14周所取標(biāo)本中，大部分可擴(kuò)增出Sry基因特異性的條帶：而兩種模型2周的標(biāo)本均未見Sry基因的存在。 三、小結(jié) 1．成體骨髓干細(xì)胞可能是腎小管上皮細(xì)胞再生的一個(gè)來源。 第二章骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對腎小管損傷的修復(fù)作用 一、材

7、料和方法 1．骨髓MSCs的原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 取Fischer 344雄性大鼠，6～8周齡，頸椎脫臼處死后，取骨髓細(xì)胞過程同前。用含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基懸浮骨髓細(xì)胞，繼而接種于25cm<'2>的塑料培養(yǎng)瓶中，密度為每瓶2×10<'7>個(gè)細(xì)胞，3天后更換培養(yǎng)液，貼壁細(xì)胞即為MSCs。待MSCs傳至第五代以后時(shí)，分別用成骨和成脂細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，以確定它們的多向分化潛能。

8、 2．急性腎衰竭模型的建立及動物分組 大鼠急性腎衰竭模型的建立采用腹腔注射HgCl<,2>的方法，劑量為2mg／kg。SD雌性大鼠分為3組：MSCs組(HgCl<,2>／MSCs)，n=10，腹腔注射HgCl<,2> 4～6小時(shí)后，每只大鼠約輸注4×10<'6>個(gè)干細(xì)胞；Saline組(HgCl<,2>／Saline)，n=10，使用無菌生理鹽水代替治療組的MSCs。另取3只正常雌性大鼠作為正常對照組。細(xì)胞及生理鹽水均通

9、過尾靜脈輸注。7天后，取材進(jìn)行分析。 3．組織學(xué)和腎臟病理損害的評分 腎組織石蠟切片2 μm厚，行HE和PAS染色。對腎小管損害程度采用百分比評分法進(jìn)行評估，計(jì)算20個(gè)顯微鏡高倍視野(×400，HPF)腎皮質(zhì)及外髓中發(fā)生損害(腎小管擴(kuò)張、萎縮、管型、細(xì)胞脫落、壞死或小管炎)的腎小管數(shù)目和總腎小管數(shù)，以發(fā)生損害的腎小管數(shù)占總腎小管數(shù)的百分比表示，最后取20個(gè)視野的平均值作為每個(gè)標(biāo)本最終的腎小管損害評分。 4．免

10、疫組織化學(xué)染色和半定量分析 腎組織石蠟切片行免疫組化染色。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)用小鼠抗人PCNA-抗體(與大鼠存在交叉反應(yīng))標(biāo)記。每個(gè)標(biāo)本分別計(jì)算腎皮質(zhì)區(qū)及外髓區(qū)20個(gè)高倍視野，進(jìn)行PCNA<'+>細(xì)胞的計(jì)數(shù)，求和后分別取其平均值作為最后數(shù)值。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，p(0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二、結(jié)果 1.MSCs向脂肪細(xì)胞

11、和成骨細(xì)胞的分化 采用貼壁法分離的MSCs，是一個(gè)異質(zhì)性群體，體外增殖能力強(qiáng)。MSCs用成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)下，可見到明顯的含有大量脂滴的脂肪細(xì)胞形成，經(jīng)蘇丹Ⅲ染色，脂滴被染成桔紅色。在用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)時(shí)，可見大量的鈣結(jié)節(jié)形成，經(jīng)茜素紅染色，含鈣的結(jié)節(jié)被染成桔紅色。 2.MSCs治療改善ARF大鼠的生存狀況 腹腔注射HgCl<,2>后，大鼠的死亡主要集中在第5～7天。7天時(shí)，MSCs組的生存率明顯高于Salin

12、e組。在體重改變上，MSCs組略有增加，Saline組則明顯下降。 3．MSCs治療改善ARF大鼠的腎功能 腎功能的檢測結(jié)果顯示，MSCs組的Scr、BUN均明顯低于Saline組，但Scr仍高于正常大鼠。 3．MSCs治療促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞損傷的修復(fù) 7天時(shí)，Saline組的皮質(zhì)和外髓質(zhì)許多小管仍可見到擴(kuò)張、管型、細(xì)胞腫脹、炎癥細(xì)胞浸潤等病變的存在，而MSCs組則明顯減輕。 4．腎小管上

13、皮細(xì)胞PCNA表達(dá)情況 PCNA是增生細(xì)胞核抗原，腎小管損傷時(shí)PCNA表達(dá)增多，隨著腎功能的恢復(fù)，PCNA<'+>細(xì)胞數(shù)會逐漸減少。HgCl<,2>致急性腎小管損傷后7天，Saline組PCNA<'+>細(xì)胞數(shù)顯著高于MSCs組。@2三、小結(jié) 1．MSCs輸注可改善HgCl<,2>導(dǎo)致的急性腎衰竭大鼠的生存狀況及腎功能； 2．MSCs輸注可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)。 第三章骨髓間質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腎小

14、管損傷修復(fù)的機(jī)制 一、材料和方法 1．EGFP質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSCs 為了追蹤注入大鼠體內(nèi)的MSCs，我們用pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs以作為標(biāo)記。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，在培養(yǎng)基中加入G418 lmg/ml進(jìn)行篩選。然后挑選表達(dá)GFP強(qiáng)的MSCs克隆進(jìn)行擴(kuò)增，用于移植。 2．免疫組織化學(xué)染色和半定量分析 腎組織石蠟切片行免疫組化染色。巨噬細(xì)胞用消鼠抗大鼠CD68單克隆抗體(ED-1)標(biāo)記。每個(gè)標(biāo)本分別計(jì)算

15、腎皮質(zhì)區(qū)及外髓區(qū)20個(gè)高倍視野(×400)，進(jìn)行EDl<'+>細(xì)胞的計(jì)數(shù)，求和后分別取其平均值作為最后數(shù)值。 3．RT-PCR 從新鮮冰凍組織中提取RNA，用RT-PCR的方法檢測TNF-a、IL-1β、MCP-1、EGF、HGF、PDGF，以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算與內(nèi)參照比值，以作為最終的數(shù)值。 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

16、 二、結(jié)果 l.MSCs在腎臟的分布 7天時(shí)，在MSCs移植組大鼠的腎組織中，僅在腎間質(zhì)偶爾可見GFP染色陽性的細(xì)胞，而在腎小球和腎小管處并沒有檢測到。 2．腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤的情況 ED-1是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，正常腎組織中巨噬細(xì)胞很少。急性腎功能衰竭時(shí)，浸潤的巨噬細(xì)胞增加，主要集中在腎小管間質(zhì)損害顯著處。7天時(shí)，Saline組ED-1<'+>細(xì)胞數(shù)顯著高于MSCs組。 3．腎組織中細(xì)胞因子的表

17、達(dá)情況 急性腎小管損傷時(shí)，一些生長因子可以促進(jìn)小管上皮細(xì)胞的修復(fù)，而一些炎癥因子的釋放則不利于細(xì)胞的修復(fù)。7天時(shí)，EGF、PDGF、HGF在MSCs組腎組織中的表達(dá)均明顯高于Saline組；促炎癥因子中，MSCs組的TNF-a明顯低于Saline組，而IL-1β和MCP-1雖比Saline組低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn)成體骨髓干細(xì)胞可能是腎小管上皮細(xì)胞再生的一個(gè)來源。MSCs輸注可改善HgCl<,2