CTGF在人近端腎小管上皮細(xì)胞上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)變中的作用研究.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化是各種原因?qū)е碌慕K末期腎病的共同通路。最近研究表明腎小上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)是腎間質(zhì)纖維化中的核心事件。結(jié)締組織生長因子(ConnectiveTissueGrowthFactor,CTGF)是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的致纖維化因子。從蛋白結(jié)構(gòu)看CTGF由4個(gè)不同的模塊組成，CTGF在體內(nèi)以包含不同模塊的全長及不同長度的片段形式存在。人們發(fā)現(xiàn)CTGF具有許

2、多復(fù)雜甚或相互矛盾的作用，聯(lián)系到其多模塊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，有作者開始從結(jié)構(gòu)-功能學(xué)角度來探討CTGF的作用基礎(chǔ)。在這些先鋒性的實(shí)驗(yàn)中提示模塊4可能具有較為突出的作用。CTGF在多種慢性腎臟病中表達(dá)增高，提示CTGF與慢性腎臟病進(jìn)展相關(guān)，進(jìn)一步的工作發(fā)現(xiàn)CTGF能參與腎臟細(xì)胞的增殖、EMT及增加腎間質(zhì)纖維物質(zhì)堆積等多種腎臟纖維化的事件。有關(guān)CTGF在腎臟纖維化中的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)如何?是否其致纖維化效應(yīng)由模塊4介導(dǎo)?目前尚未見報(bào)道。本研究采用重組的不

3、同片段的CTGF來直接研究CTGF在EMT中的作用及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 方法：人近端腎小管上皮細(xì)胞株(humanproximaltubularcellline，HPTCL)HK-2用含10％胎牛血清(fetalcalfserum，F(xiàn)CS)的低糖型Dulbeccos'sModifiedEagle'sMedium(DMEM)培養(yǎng)液培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)24小時(shí)后，用重組CTGF(C)(只包含模塊4)干預(yù)細(xì)胞，通過MTT法監(jiān)測細(xì)胞增殖指數(shù)，摸索出

4、最適濃度-時(shí)間點(diǎn)，用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測其對細(xì)胞周期的作用及抗CTGF抗體對這一作用的影響。選取50ng/mlrhCTGF(C)干預(yù)細(xì)胞0-48h，通過免疫細(xì)胞化學(xué)、Real-TimePCR觀察其對角蛋白、波形蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變，采用共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察其對纖維連接蛋白表達(dá)的影響。在此基礎(chǔ)上我們還采用免疫細(xì)胞化學(xué)、Real-TimePCR技術(shù)觀察0-72hILK(integrin-linkedkina

5、se)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系；觀察不同濃度rhCTGF(C)(0-50ng/ml)作用細(xì)胞48h后，HK-2細(xì)胞ILKmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的濃度效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)我們還觀察了抗CTGF抗體對rhCTGF(C)的這些作用的影響以及比較了rhCTGF(N)(包含模塊1，2，3不包括模塊4)對這些指標(biāo)的作用。 結(jié)果：結(jié)果顯示在50ng/ml范圍內(nèi)rhCTGF(C)能促進(jìn)HK-2細(xì)胞增殖，呈濃度依賴性增強(qiáng)(P＜0.05)。在100

6、ng/ml-lug/ml濃度范圍內(nèi)rhCTGF(C)呈濃度依賴性抑制HK-2細(xì)胞生長(P＜0.05)。50ng/mlrhCTGF(C)作用HK-2細(xì)胞12h后即可顯著性誘使HK-2細(xì)胞增殖(P＜0.05)，此作用呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)。rhCTGF(C)作用48h后，G0-G1期細(xì)胞減少(p＜0.05)，S期細(xì)胞增多(p＜0.01)，anti-CTGFantibody干預(yù)后能明顯減輕這一現(xiàn)象(P＜0.05)。rhCTGF(C)可以呈時(shí)間依賴性

7、下調(diào)CK(cytokeratin)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)及上調(diào)VIM(vimentin)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)(P分別＜0.05vscontrol)。RhCTGF(C)可以明顯使HK-2細(xì)胞伸長為長梭形。rhCTGF(C)可以增加FN(fibronectin)的合成，呈時(shí)間依賴性(P＜0.05)。RhCTGF(C)在5ng/ml時(shí)就可以增加ILKmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，呈濃度依賴性(P＜0.05)。RhCTGF(C)作用24h起即可上調(diào)ILK

8、mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)(P＜0.05)，并呈時(shí)間依賴性?？笴TGF抗體可以阻斷這些作用(P＜0.05)，而rhCTGF(N)與正常對照組相比無明顯改變。 結(jié)論： 1.在一定的濃度范圍內(nèi)，重組的CTGF模塊4蛋白可以促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的增殖，呈濃度和時(shí)間依賴性；加速腎小管上皮細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變。 2.重組的CTGF模塊4蛋白可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，而rhCTGF(N)未能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。