豬后腎帽狀間充質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育及對(duì)腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、目的:探討豬后腎帽狀間充質(zhì)細(xì)胞(metanephric cap mesenchyme cells,MCMCs)及腎小球的發(fā)育過(guò)程,以及MCMCs對(duì)腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)的影響。
　　方法:
　　1.豬MCMCs及腎小球發(fā)育的研究:過(guò)碘酸-希夫氏(periodic acid-Schiff,PAS)染色觀察中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬不同時(shí)間點(diǎn)后腎帽狀間充質(zhì)

2、細(xì)胞及腎小球發(fā)育過(guò)程的形態(tài)學(xué)變化;免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬胚腎不同階段腎小球足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程及相互關(guān)系。
　　2.豬MCMCs對(duì)腎小管EMT影響的研究:10ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)分別誘導(dǎo)豬近端小管上皮細(xì)胞系(LLC-PK1)24h、48h、72h,建立LLC-PK1細(xì)胞EMT的體外模型;將分離的原代豬MCMCs與TGF-

3、β1誘導(dǎo)的LLC-PK1細(xì)胞在Transwell系統(tǒng)中共培養(yǎng),研究MCMCs對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LLC-PK1細(xì)胞EMT的影響。
　　結(jié)果:
　　1.豬MCMCs及腎小球的發(fā)育過(guò)程:
　　(1)不同時(shí)間點(diǎn)豬腎小球發(fā)育的形態(tài)學(xué)改變:豬腎組織PAS染色顯示,胚胎第28天(E28d)后腎已開(kāi)始發(fā)育,可見(jiàn)到呈“T”型分支的輸尿管芽(ureteric bud,UB),后腎間充質(zhì)(metanephric mesenchyme,MM

4、)圍繞UB呈帽狀分布(帽狀間充質(zhì)),并可見(jiàn)到典型的腎小囊體、逗號(hào)形體及“S”形體。E35d可見(jiàn)腎小球形成,包括近皮質(zhì)生腎區(qū)的不成熟腎小球(毛細(xì)血管袢期腎小球)和近髓質(zhì)成熟腎小球(腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞)。豬在E112d-E114d出生,出生后1天(P1d)、7天(P7d)和14天(P14d)腎臟繼續(xù)發(fā)育,腎臟被膜下仍有生腎區(qū)存在,仍可見(jiàn)到帽狀間充質(zhì)、腎小囊體、逗號(hào)形體、“S”形體及毛細(xì)血管袢期腎小球;P21d生腎區(qū)消失,腎臟發(fā)生停

5、止。
　　(2)不同時(shí)間點(diǎn)豬后腎帽狀間充質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程:免疫熒光結(jié)果顯示,后腎帽狀間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Six2廣泛表達(dá)于豬后腎帽狀間充質(zhì)細(xì)胞,E28d表達(dá)水平最高,隨著胚腎不斷發(fā)育,腎皮質(zhì)生腎區(qū)的相對(duì)厚度逐漸變薄,Six2的表達(dá)水平也逐漸降低,P21d生腎區(qū)消失,Six2的表達(dá)也隨之消失。Six2與足細(xì)胞標(biāo)志物WT1同部位表達(dá)。
　　(3)豬腎小球發(fā)育不同階段固有細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)及形態(tài)變化:豬腎組織免疫熒光染色顯示,胚腎早期,

6、足細(xì)胞標(biāo)志物WT1廣泛表達(dá)于后腎帽狀間充質(zhì)細(xì)胞,相繼表達(dá)于腎小囊體、整個(gè)逗號(hào)形體、逗號(hào)形體尾部、“S”形體下端和腎小球足細(xì)胞;內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31在胚腎早期呈散在性分布,繼而圍繞腎小囊體和逗號(hào)形體分布,然后進(jìn)入“S”形體下端的血管裂隙聚集形成無(wú)管腔的“前毛細(xì)血管束”,最后定位在成熟腎小球的毛細(xì)血管內(nèi);系膜細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA在早期胚腎、腎小囊體和逗號(hào)形體階段均無(wú)表達(dá),“S”形體早期分布于“S”形體周?chē)?后期進(jìn)入血管裂隙,毛細(xì)血管袢期聚

7、集在腎小球血管極根部,隨著腎小球發(fā)育,逐漸向腎小球內(nèi)延伸,最終表達(dá)于成熟腎小球系膜區(qū)。
　　2.豬MCMCs對(duì)腎小管EMT的抑制作用:10ng/mlTGF-β1刺激LLC-PK1細(xì)胞24h、48h、72h后可成功誘導(dǎo)EMT,表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞樣,細(xì)胞長(zhǎng)/寬比率增加;細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少,間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和vimentin表達(dá)增加,誘導(dǎo)72h后效果最明顯。原代豬MCMCs可部分抑制TGF-β1

8、誘導(dǎo)的LLC-PK1細(xì)胞EMT,表現(xiàn)為抑制細(xì)胞長(zhǎng)/寬比率的增加,抑制E-cadherin的表達(dá)下調(diào),抑制間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、vimentin的表達(dá)上調(diào),同時(shí)還可抑制EMT信號(hào)通路分子β-catenin、ZEB1的表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:豬在E28d后腎已開(kāi)始發(fā)育,E35d形成腎小球,P14d-P21d腎臟發(fā)生停止;豬腎小球發(fā)育過(guò)程與人類(lèi)相似,腎小球足細(xì)胞來(lái)源于Six2陽(yáng)性的MCMCs;在腎小球血管叢形成過(guò)程中,足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與