血管內皮生長因子對TGF-β1誘導的腎小管上皮-間充質細胞轉化的作用及機制探討.pdf

1、第一部分血管內皮生長因子(VEGF)對TGF-β1誘導的腎小管上皮-間充質細胞轉化(EMT)的作用
　　 背景與目的：
　　 腎小管上皮-間充質細胞轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)在腎間質纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1被認為是誘導EMT的主要因子之一。血管內皮生長因子(vascular e

2、ndothelial growth factor，VEGF)是調節(jié)血管發(fā)生的基本生長因子。近來許多研究發(fā)現VEGF在許多腎臟病中包括腎纖維化中發(fā)揮了保護作用。本部分的研究目的是探討VEGF對TGF-β1誘導的EMT的作用。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞(HK-2)分為：
　　 (1)正常對照組；
　　 (2)TGF-β1（5μg/L）陽性對照組；
　　 (3)TGF-β1(5μg

3、/L)+VEGF165(0.1、1、10、100μg/L)共同作用組；體外作用48h，免疫組化雙染、激光掃描共聚焦方法檢測各組HK-2細胞α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達情況，RT-PCR法、WestemBlot法檢測各組細胞α-SMA、E-cadherin、波形蛋白(Vimentin)的mRNA及蛋白水平。ELISA測定培養(yǎng)液上清中纖維連接蛋白(fi

4、bronectin，FN)和Ⅰ型膠原（collagen I，COLI）的表達情況。
　　 結果：
　　 免疫組化雙染、激光掃描共聚焦結果顯示TGF-β1陽性對照組與正常對照組相比較，α-SMA表達水平顯著增強，而E-cadherin表達顯著減弱；TGF-β1與VEGF165共同作用組α-SMA表達與陽性對照組相比明顯減弱，而E-cadherin表達明顯增強，且呈VEGF165劑量依賴的關系。Western blot、RT

5、-PCR和ELISA結果顯示TGF-β1作用組細胞α-SMA、Vimentin表達及培養(yǎng)液上清中FN、COLI比正常對照組明顯增強，而E-cadherin表達明顯減弱；TGF-β1與VEGF165共同作用組α-SMA、Vimentin表達及培養(yǎng)液上清中FN、COLI比TGF-β1陽性對照組明顯減弱，而E-cadherin表達增強，且呈VEGF165劑量依賴的關系。TGF-β1+VEGF165(10、100μg/L)共同作用組與TGF-β

6、1陽性對照組相比，α-SMA、Vimentin表達及培養(yǎng)液上清中FN、COLI水平顯著降低，而E-cadherin表達則顯著增強(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 TGF-β1能誘導體外培養(yǎng)的HK2細胞發(fā)生EMT，VEGF165能以濃度依賴方式抑制TGF-β1誘導HK-2細胞發(fā)生EMT。
　　 第二部分VEGF抑制TGF-β1誘導的EMT過程中Smad、Erk信號途徑及SnoN表達的變化
　　 背景與

7、目的：
　　 TGF-β1主要通過Smad和非Smad信號（包括Erk1/2等）轉導途徑參與調節(jié)腎小管上皮-間充質細胞轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT);在TGF-β1信號通路中，SnoN作為輔助調節(jié)因子，抑制Smad蛋白介導的轉錄活性，從而負性調節(jié)基因的表達。本部分的研究目的是探討VEGF抑制TGF-β1誘導HK-2細胞發(fā)生EMT的過程中對Smad2/3，Smad7，Erk1/2

8、信號途徑以及SnoN表達的影響。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)的HK-2細胞分為：
　　 (1)正常對照組；
　　 (2)TGF-β1(5μg/L)陽性對照組；
　　 (3)VEGF165(100μg/L)作用組；
　　 (4)TGF-β1+VEGF165共同作用組：TGF-β1(5μg/L)與VEGF165(100μg/L)共同作用，Western Blot法和RT-PCR分別檢測各組細

9、胞p-Smad2/3和Smad2/3、p-Erk1/2和Erk1/2(共同作用30和60min)，α-SMA、Smad7、SnoN表達水平(共同作用48h)。
　　 結果：
　　 1、Western Blot顯示TGF-β1組α-SMA蛋白表達與正常對照組比較明顯增強，TGF-β1與VEGF165共同作用組α-SMA蛋白表達與陽性對照組比較明顯減弱(p＜0.05)；
　　 2、HK2細胞體外刺激30min、60m

10、in，TGF-β1組與正常對照組比較，(p-Smad2/3)/(Smad2/3)及(p-Erk1/2)/(Erk1/2)比值明顯升高，TGF-β1+VEGF165組與陽性對照組相比二者均明顯下降，且均以30min下降明顯；
　　 3、體外刺激48h，TGF-β1組與正常對照組相比較，Smad7蛋白和mRNA明顯下降，VEGF165+TGF-β1組較陽性對照組Smad7明顯升高(p＜0.05)；
　　 4、VEGF165單

11、獨處理組與正常對照組相比，(p-Erk1/2)/(Erk1/2)比值明顯升高(p＜0.05)，α-SMA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)、Smad7蛋白和mRNA表達均無明顯差異(p＞0.05)；
　　 5、TGF-β1組SnoN蛋白表達與正常對照組比較明顯增強(p＜0.05)，TGF-β1與VEGF165共同作用組SnoN蛋白表達與陽性對照組相比無明顯差異(p＞0.05)，各組SnoNmRNA表達均無明顯差異(p＞

12、0.05)。
　　 結論：
　　 VEGF165抑制TGF-β1誘導HK-2細胞EMT的機制可能與直接抑制Smad2/3磷酸化、上調Smad7信號表達，以及間接抑制Erk1/2信號磷酸化有關；而與SnoN表達無關。
　　 第三部分VEGF通過PI3K信號途徑抑制TGF-β1誘導的EMT
　　 背景與目的：
　　 VEGF與其受體結合后可激活多種信號轉導途徑。其中PI3K/Akt信號轉導途徑是VEG

13、F發(fā)揮各種生理病理作用的重要通路。結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）一方面作為TGF-β1的下游介質介導細胞增殖和細胞外基質（包括FN，COLI等）的產生，另一方面CTGF也可直接誘導腎小管上皮-間充質細胞轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的發(fā)生。本部分的研究目的是探討VEGF是否通過PI3K/Akt信號途徑參與抑制TGF-β1誘導

14、HK-2細胞發(fā)生EMT的作用；以及VEGF是否通過該信號途徑發(fā)揮對Smad信號途徑以及CTGF和細胞外基質表達的影響。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)的HK-2細胞分組為：
　　 (1)正常對照組；
　　 (2)TGFβ1（5μg/L）陽性對照組；
　　 (3)VEGF165(100μg/L)；
　　 (4)TGFβ1(5μg/L)+VEGF165(100μg/L)組；
　　 (5)

15、LY294002作用組(25μmol/L)；
　　 (6)TGFβ1（5μg/L）+LY294002(25μmol/L)；
　　 (7)VEGF165(100μg/L)+LY294002(25μmol/L)；
　　 (8)TGFβ1(5μg/L)+VEGF165(100μg/L)+LY294002（25μmol/L）組。
　　 激光掃描共聚焦方法檢測各組HK-2細胞的α-SMA、E-cadherin表達，

16、Western Blot法和RT-PCR檢測各組細胞p-Smad2/3和Smad2/3（共同作用30min）、Smad7、α-SMA、CTGF表達水平(共同作用48h)。ELISA檢測各組細胞的培養(yǎng)液上清中FN和COLI的表達。
　　 結果：
　　 TGF-β1作用組α-SMA與CTGF蛋白和mRNA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)及細胞的培養(yǎng)液上清中FN、COLI表達與正常對照組相比較明顯增強，而E-cad

17、herin、Smad7表達明顯減弱；TGFβ1與VEGF165共同作用組α-SMA與CTGF蛋白和mRNA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)及培養(yǎng)液上清中FN、COLI表達比TGFβ1陽性對照組明顯減弱，而E-cadherin、Smad7表達明顯增強。TGFβ1+LY294002共同作用組α-SMA與CTGF蛋白和mRNA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)及培養(yǎng)上清中FN、COLI表達比TGF-β1作用組輕度下降，E

18、-cadherin、Smad7表達輕度升高，但差異均無統(tǒng)計學意義。TGFβ1+VEGF165組中加入LY294002后，α-SMA與CTGF蛋白和mRNA、(p-Smad2/3)/（Smad2/3）及培養(yǎng)上清中FN、COLI表達均明顯增強，E-cadherin、Smad7表達減弱，與TGF-β1作用組相比差異無明顯統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 VEGF165抑制TGF-β1誘導HK-2細胞發(fā)生的EMT，其機制可能與V

19、EGF通過PI3K信號轉導通路抑制Smad信號活化、下調HK-2細胞CTGF表達及減少細胞外FN、COLI合成有關。
　　 第四部分VEGF抑制TGF-β1誘導的EMT過程中BMP-7/Smad1,5，8信號途徑表達的變化
　　 背景與目的：
　　 骨形成蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7，BMP-7）能維持腎小管上皮細胞形態(tài)、功能并逆轉腎小管上皮-間充質細胞轉化（Epitheli

20、al-Mesenchymal Transition，EMT）。BMP-7主要通過激活Smad1/5/8信號轉導途徑發(fā)揮作用。本部分的研究目的是探討VEGF抑制EMT的作用與BMP-7及其信號轉導途徑表達變化的關系。
　　 方法：
　　 將體外培養(yǎng)的HK-2細胞分為正常對照組、陽性對照組(TGF-β1,5μg/L)、TGF-β1（5μg/L）+VEGF165(0.1-100μg/L)共同作用組，HK-2體外培養(yǎng)30min、

21、60min、24h、48h，用Western Blot方法檢測不同組BMP-7以及p-Smad1/5/8。Smad1/5/8表達變化（以磷酸化與非磷酸化比值表示信號的磷酸化水平）；選取VEGF165對Smad1/5/8信號磷酸化作用最大的時間點用Western Blot方法檢測其劑量依賴的關系。
　　 結果：
　　 TGF-β1組BMP-7蛋白表達與正常對照組相比較明顯減弱；TGF-β1與VEGF165共同作用組BMP-

22、7蛋白表達與陽性對照組相比有增強趨勢，且表現為VEGF165劑量依賴性。HK-2體外培養(yǎng)不同時間，TGF-β1（5μg/L）十VEGF165(100μg/L)組(p-Smad1/5/8)/(Smad1/5/8)在30min時達最高峰，隨時間延長呈下降趨勢。HK-2細胞體外培養(yǎng)30min，TGF-β1(Sμg/L)+VEGF165(0.1-100μg/L)組(p-Smad1/5/8)/(Smad1/5/8)呈上升趨勢，表現為VEGF165

23、劑量依賴性。單獨TGF-β1處理幾乎不能激活Smad1/5/8的磷酸化。
　　 結論：
　　 VEGF165抑制TGF-β1誘導的體外培養(yǎng)的HK-2細胞發(fā)生EMT，其機制可能與VEGF上調BMP-7后激活Smad1/5/8信號有關。
　　 第五部分VEGF通過Id2抑制TGF-β1誘導的體外HK-2細胞發(fā)生EMT
　　 背景與目的：
　　 分化抑制因子(inhibitor of DNA bindi

24、ng/differentiation，Id)是一組能夠對堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉錄因子活性起負調節(jié)作用的轉錄因子。哺乳類動物細胞含Id1-Id4共4種Id因子，該分子參與細胞分化、細胞衰老、神經形成、凋亡及血管生成等過程。我們既往的研究顯示VEGF165抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮-間充質細胞轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)機制可能與VEGF165上調Id2的表達有關，而與I

25、d3表達無關。本部分的研究目的是進一步明確VEGF165是否通過Id2抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞發(fā)生EMT。
　　 方法：
　　 將體外培養(yǎng)的HK-2細胞分為非沉默siRNA與Id2沉默siRNA，然后分別給予TGF-β1(5μg/L)、VEGF165（100μg/L）、TGF-β1(5μg/L)+VEGF165（100μg/L）刺激及不加刺激，HK-2細胞體外培養(yǎng)48h，分別用Western Blot和RT-P

26、CR方法檢測不同組Id2、α-SMA以及E-cadherin的蛋白和mRNA的表達。
　　 結果：
　　 非沉默siRNA處理后，TGF-β1誘導的Id2蛋白表達與不加刺激組相比明顯減弱；TGF-β1與VEGF165共同刺激組Id2蛋白表達與單用TGF-β1刺激相比明顯增強(P＜0.05)。與非沉默siRNA處理的細胞相比，Id2沉默siRNA處理后，同樣給予TGF-β1刺激，TGF-β1誘導的α-SMA的蛋白和mRNA

27、表達進一步增加，E-cadherin的蛋白和mRNA表達進一步減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。同樣給予TGF-β1與VEGF165共同刺激，Id2沉默siRNA處理與非沉默siRNA處理的細胞相比，α-SMA的蛋白和mRNA表達明顯增加，E-cadherin的蛋白和mRNA表達明顯減少。
　　 結論：
　　 VEGF165通過Id2抑制了TGF-β1誘導的體外培養(yǎng)的HK-2細胞發(fā)生EMT。
　　 第六部

28、分外源性VEGF對UUO小鼠腎間質纖維化和EMT的作用及機制的探討
　　 背景與目的：
　　 腎小管上皮-間充質細胞轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是腎間質纖維化的主要細胞機制之一。TGF-β1、CTGF是主要的致纖維化因子，在EMT的發(fā)生和發(fā)展過程中的起重要作用。而BMP-7是維持腎小管上皮細胞功能的重要因子之一并能逆轉EMT，體內實驗顯示BMP-7能減輕大鼠腎間質纖維

29、化。我們以前體外的研究結果顯示，VEGF能抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞發(fā)生EMT，其機制可能與VEGF下調CTGF，上調BMP-7有關。本研究目的在于探討VEGF對UUO小鼠的腎間質纖維化及EMT的作用及其和TGF-β1、CTGF及BMP-7表達變化的關系。
　　 方法：
　　 雄性CD-1小鼠36只，體重21-24g，分為3組：
　　 1、假手術組（n=12）；
　　 2、UUO模型組（n=12）

30、；
　　 3、UUO+VEGF處理組(n=12)：VEGF12150μg·kg-1,2/d，皮下注射。
　　 分別于第3、7、14天處死動物，留取梗阻側的腎臟組織。行HE和Masson染色評估腎間質纖維化程度；免疫組化法檢測腎臟組織α-SMA表達情況；Western Blot、RT-PCR方法檢測腎臟組織α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、CTGF及BMP-7蛋白和mRNA水平的表達情況。
　　 結果

31、：
　　 在同一時間點與假手術組相比較，UUO模型組第3、7、14d腎間質纖維化程度明顯加重(P＜0.05)，隨梗阻時間延長，UUO模型組腎間質纖維化程度不斷加重(P＜0.05)；在第3、7d，VEGF處理組較UUO模型組腎間質纖維化程度明顯減輕(P＜0.05)。與假手術組相比較，UUO模型組在第3、7、14d的α-SMA、TGF-β1和CTGF的蛋白及mRNA表達水平明顯增強，E-cadherin、BMP-7表達明顯減弱(P＜

32、0.05)，隨著梗阻時間的延長，UUO模型組α-SMA、TGF-β1和CTGF的表達水平不斷增強，E-cadherin、BMP-7表達不斷減弱(P＜0.05)；在第3、7d，VEGF處理組較UUO模型組α-SMA、TGF-β1和CTGF的表達水平明顯減輕，E-cadherin、BMP-7表達明顯增強(P＜0.05)。在第14d，VEGF處理組僅CTGF的表達仍明顯減輕(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 在UUO慢性纖