TGF-β1預(yù)處理對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制的探討.pdf

1、第一部分：TGF-β1預(yù)處理在BMSC凋亡過程中的作用。 引文：BMSC即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是存在于骨髓基質(zhì)中的非造血組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，它具有向多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞分化的能力。在機(jī)體受到外傷，疾病，老化等損傷時(shí)，BMSC可增殖分化，并可釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如BDNF（腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子），NGF（神經(jīng)生長(zhǎng)因子），并參與神經(jīng)組織損傷的修復(fù)。BMSC主要應(yīng)用于移植,但是在單純移植BMSC后，BMSC易受到各種外界環(huán)境

2、因素的影響而凋亡，不能較好地參與組織損傷修復(fù)過程。本研究應(yīng)用小劑量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1對(duì)BMSC進(jìn)行預(yù)處理，觀察小劑量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1預(yù)處理是否使BMSC具有抗凋亡的能力。 目的：觀察經(jīng)TGF-β1預(yù)處理后的BMSC凋亡的情況，并篩選出使BMSC具有最強(qiáng)抗凋亡能力的條件，即TGF-β1預(yù)處理的時(shí)間點(diǎn)和濃度。 方法：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P2代BMSCs，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后,改用含0.5％新生小牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)

3、24小時(shí),使細(xì)胞趨于同步化。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液稀釋成5×104／ml，接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔10ml細(xì)胞懸液，分為預(yù)處理組及空白對(duì)照組，分別在預(yù)處理組的各孔中加入2ng/mlTGF-β1，不加TGF-β1為空白對(duì)照組，預(yù)處理組又分為TGF-β1預(yù)處理后24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)組。再將各組細(xì)胞改用無血清培養(yǎng)基（作為一種誘導(dǎo)凋亡的條件）培養(yǎng)48小時(shí)，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果： 1.體外分離純化

4、的骨髓MSCs,所挑取的單克隆擴(kuò)增細(xì)胞呈典型成纖維樣細(xì)胞形態(tài)。 2.光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)BMSC在TGF-β1預(yù)處理后12小時(shí)開始凋亡，24小時(shí)呈繼續(xù)上升趨勢(shì)，48小時(shí)時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)開始減少，72小時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)又繼續(xù)增多。 3.經(jīng)24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡率（AI％）分別為33.5％，23.2％，52.2％。4.相應(yīng)的空白對(duì)照組在24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)的細(xì)胞凋亡率（AI％）分別為31.2％，47.2％，

5、56.3％。 結(jié)論：經(jīng)2ng/mlTGFβ-1預(yù)處理48小時(shí)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)抗凋亡能力。經(jīng)2ng/ml TGFβ-1預(yù)處理48小時(shí)的BMSC可以在無血清培養(yǎng)基中生存48個(gè)小時(shí)。TGF-β1在特定條件下對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有保護(hù)作用,可以抑制其凋亡，提高BMSC在移植過程中的存活率。 第二部分：TGF-β1預(yù)處理對(duì)抗BMSC凋亡作用機(jī)制的研究。 引言：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的死亡形式之一，caspase在誘發(fā)凋

6、亡過程中是起著必不可少的作用，而Bcl-2基因及其蛋白則是抑制細(xì)胞凋亡的重要物質(zhì)。本研究用免疫組化方法檢測(cè)經(jīng)小劑量TGF-β1預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中BCL-2和Caspase-3的表達(dá),旨在探討小劑量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1預(yù)處理使BMSC具有抗耐受凋亡的能力的原因及機(jī)制。 目的：通過檢測(cè)經(jīng)TGF-β1預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中BCL-2和Caspase-3的表達(dá)，研究小劑量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1預(yù)處理具有對(duì)抗BMSC凋亡的作用機(jī)

7、制。 方法：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液稀釋成5×104／ml，接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為預(yù)處理組及空白對(duì)照組，置37 ℃，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，收集細(xì)胞并制備細(xì)胞爬片.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)BCL-2,caspase-3的表達(dá)。每種抗原的染色均分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色。陽性標(biāo)準(zhǔn)為棕黃色。各隨機(jī)抽取10個(gè)不重疊的視野,計(jì)算陽性細(xì)胞的數(shù)量,應(yīng)用HPIAS21000高清晰度彩色病理圖

8、文報(bào)告分析系統(tǒng)，對(duì)BCL-2,caspase-3的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果：BMSCsBCL-2,Caspase-3的表達(dá):BCL-2,CAS-3染色陽性部位在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,將3個(gè)預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)的2組細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色分析,并分別取5個(gè)不同視野,進(jìn)行陽性細(xì)胞記數(shù)。24小時(shí)和72小時(shí)處理組的BCL-2表達(dá)及CASPASE-3表達(dá)較對(duì)照組差異顯著性不明顯(P>0.05).48小時(shí)處理組的BCL-2表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P<0.05