微小RNA-129促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化及其作用機(jī)制的探討.pdf

1、心肌梗死是近年來常見的心血管疾病，雖然常規(guī)的藥物和手術(shù)治療能夠一定程度的改善癥狀，但鑒于心肌細(xì)胞的不可再生性，以及心梗后梗死區(qū)由瘢痕組織替代，難以避免的會(huì)發(fā)生終末期心力衰竭，因此干細(xì)胞的心肌再生治療成為近年來的研究熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSCs）憑借其易于培養(yǎng)、多向分化潛能、無倫理道德爭議等特點(diǎn)被認(rèn)為是心肌再生治療中急劇前景的種子細(xì)胞之一。目前認(rèn)為BM-MSCs

2、通過多種途徑參與修復(fù)心肌梗死后的心肌細(xì)胞損傷，主要包括：對(duì)抗凋亡、促血管新生、動(dòng)員外周干細(xì)胞、旁分泌所衍生的復(fù)合效應(yīng)、心肌分化途徑等。但是參照以往的文獻(xiàn)提示：BM-MSCs在注射入心肌后，向心肌細(xì)胞分化的比率極低，因此針對(duì)于誘導(dǎo)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化的研究具有重要的意義。目前認(rèn)為BM-MSCs在體外誘導(dǎo)下向心肌細(xì)胞分化的具體機(jī)制涉及多條信號(hào)通路以及多種節(jié)點(diǎn)蛋白的聯(lián)合效應(yīng)，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。在所有參與調(diào)控BM-MSCs向心肌細(xì)

3、胞分化所涉及的信號(hào)機(jī)制和基因調(diào)控過程中，我們認(rèn)為Wnt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)干細(xì)胞下游基因表達(dá)的關(guān)鍵信號(hào)之一，是哺乳動(dòng)物系細(xì)胞生長發(fā)育、腫瘤形成等過程中不可獲取的組成部分，發(fā)揮著精確的調(diào)控作用。有研究證實(shí)在干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過程中有Wnt蛋白的參與，調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新與分化之間的平衡，亦有研究發(fā)現(xiàn)外源性激活Wnt能夠開啟核下游心肌分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。因此，我們認(rèn)為在BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化過程中Wnt信號(hào)通路扮演著重要的調(diào)控角色，研

4、究其內(nèi)源性調(diào)控機(jī)制對(duì)于明確如何促進(jìn)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化具有重要的意義。
　　微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度約為20-24個(gè)核苷酸，成熟的miRNA能夠與靶信使RNA（message RNA，mRNA）3’UTR端的特定核酸序列互補(bǔ)識(shí)別，從而抑制或降解其mRNA的翻譯，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，廣泛的存在于病毒、線蟲、植物動(dòng)物體內(nèi)，并涉及幾乎所有的細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生命過程

5、。有研究發(fā)現(xiàn)，在干細(xì)胞向心肌分化過程中，多種miRNA具有顯著的調(diào)控作用，其中部分miRNA正是通過開啟Wnt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)心肌分化相關(guān)的下游通路激活。本實(shí)驗(yàn)研究通過構(gòu)建miRNA-129慢病毒載體，進(jìn)而研究過表達(dá)miRNA-129是否能夠激活BM-MSCs內(nèi)的Wnt通路，從而開啟下游與心肌分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終促進(jìn)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化。并針對(duì)miRNA-129在Wnt通路中的作用節(jié)點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步明確miRNA-129促

6、進(jìn)BM-MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的作用機(jī)制。
　　第一部分: BM-MSCs的體外獲取、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：利用密度梯度離心法獲取大鼠BM-MSCs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)和鑒定。
　　方法：采用2周齡SD(Sprague-Dawley rat)雄性大鼠，脫頸法處死，無菌條件下仔細(xì)剔除股骨部分的肌肉韌帶，DMEM低糖培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，采用密度梯度離心法獲取BM-MSCs，隨后接種于培養(yǎng)皿中置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)BM-MSCs

7、貼壁的特性，經(jīng)過24小時(shí)培養(yǎng)后，棄除上清，移除游離細(xì)胞，胰酶法消化細(xì)胞離壁，進(jìn)一步純化細(xì)胞后傳代接種。細(xì)胞傳至第二代，利用流式細(xì)胞儀鑒定BM-MSCs表面抗原分子CD90、CD29、CD45以及CD31的表達(dá)；利用成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞三系分化，檢測干細(xì)胞的體外分化能力。
　　結(jié)果：利用密度梯度離心法獲取的BM-MSCs經(jīng)過體外培養(yǎng)，傳代純化后，形態(tài)呈梭型、長短不一，符合BM-MSCs特性，細(xì)胞呈現(xiàn)集落樣生長，具有克隆形

8、成能力。通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定，證明BM-MSCs高表達(dá)CD90和CD29；低表達(dá)CD45和CD31。利用特異性誘導(dǎo)劑對(duì)BM-MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，證實(shí)BM-MSCs具有向骨、軟骨、脂肪三系分化的能力。
　　結(jié)論：利用密度梯度離心法獲取的BM-MSCs細(xì)胞，呈長梭形貼壁生長，表面抗原符合BM-MSCs的特性，且經(jīng)誘導(dǎo)能夠向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞分化，表明密度梯度離心法能夠有效分離BM-MSCs。
　　第二部分：慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染

9、構(gòu)建過表達(dá)目的基因的BM-MSCs
　　目的：利用慢病毒轉(zhuǎn)染分別構(gòu)建過表達(dá)miRNA-129的BM-MSCs（miR-129-MSCs），以及過表達(dá)GSK-3β的BM-MSCs（GSK-3β-MSCs）和同時(shí)過表達(dá)miRNA-129和GSK-3β的BM-MSCs（miR-129+GSK-3β-MSCs）。
　　方法：取第一部分中的BM-MSCs傳至第3代，實(shí)驗(yàn)分為五組：①正常對(duì)照組（MSCs組）：未干預(yù)的BM-MSCs；②慢

10、病毒空轉(zhuǎn)組（Lv-MSCs組）：加入空載慢病毒載體轉(zhuǎn)染BM-MSCs（pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP），轉(zhuǎn)染12小時(shí)后更換為正常DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)，再次用空載的慢病毒載體（pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP）轉(zhuǎn)染12小時(shí)，置換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后加入嘌呤霉素培養(yǎng)基（10ug/ml）殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再次更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；③miRNA-129過表達(dá)組（miR-129-MSCs）：加入包載mi

11、RNA-129的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12小時(shí)后更換為正常培養(yǎng)基；④GSK-3β過表達(dá)組（GSK-3β-MSCs）：加入包載GSK-3β的pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO慢病毒載體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12小時(shí)后更換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，隨后加入嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選，殺死對(duì)照組細(xì)胞后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。⑤miRNA-129和GSK-3β雙轉(zhuǎn)染組（miRNA-129+GSK-3β-M

12、SCs），未干預(yù)的BM-MSCs先經(jīng)miRNA-129慢病毒轉(zhuǎn)染后再行GSK-3β慢病毒轉(zhuǎn)染，步驟同③④。隨后利用real-time PCR法檢測五組細(xì)胞中miRNA-129以及GSK-3β的基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：上述各組BM-MSCs經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后行real-time PCR檢測目的基因，第③組中miRNA-129的基因表達(dá)量高于對(duì)照組（9.22±1.68 VS1.08±0.41，P＜0.05），第⑤組中miRNA-12

13、9的基因表達(dá)量高于對(duì)照組（9.68±3.73 VS1.08±0.41，P＜0.05）；第④組中GSK-3β的基因表達(dá)量高于對(duì)照組（14.73±3.42 VS1.01±0.34，P＜0.05），第⑤組中GSK-3β的基因表達(dá)量亦高于對(duì)照組（11.44±2.65 VS1.01±0.34，P＜0.05）。
　　結(jié)論：經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，成功獲得過表達(dá)miRNA-129的miR-129-MSCs組、過表達(dá)GSK-3β的GSK-3β-MSC

14、s組和同時(shí)過表達(dá)miRNA-129和GSK-3β的miR-129+GSK-3β-MSCs組，為后續(xù)的向心肌分化相關(guān)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三部分： miRNA-129促進(jìn)BM-MSCs向心肌樣細(xì)胞分化機(jī)制
　　目的：探討體外條件下過表達(dá)miRNA-129對(duì)BM-MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的影響，并探討其中可能涉及Wnt信號(hào)通路的機(jī)制。
　　方法：獲取第二部分中的五組細(xì)胞，常規(guī)低糖DMEM培養(yǎng)。設(shè)置以第②③④⑤組完成轉(zhuǎn)

15、染的當(dāng)日為第0天，在時(shí)間點(diǎn)第5天、10天、15天、20天收取細(xì)胞，裂解后提取總RNA，利用real-time PCR檢測五組BM-MSCs中心肌特異性基因（Nkx2.5、GATA-4、MEF-2C）的表達(dá)；另取第15天的五組BM-MSCs，裂解后提取蛋白，利用western blot檢測心肌特異性蛋白（cTn-I、Desmin）的表達(dá)，以及非磷酸化β-catenin、磷酸化β-catenin、GSK-3β的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果

16、：自第5天至第20天realtime-PCR提示第①②組中心肌特異性基因（Nkx2.5、GATA-4、MEF-2C）的轉(zhuǎn)錄水平基本無顯著變化，而第③⑤組中的心肌特異性基因（Nkx2.5、GATA-4、MEF-2C）轉(zhuǎn)錄水平隨時(shí)間延長逐漸升高，其中第3組的升高幅度顯著高于第⑤組（P＜0.01），第③組中心肌特異性基因的表達(dá)于第15天之后呈現(xiàn)不同程度的下降，仍顯著高于其余四組（P＜0.01）；此外第15天western blot檢測顯示，心

17、肌特異性蛋白（cTn-I、Desmin）第15天時(shí)在第①②④組中幾乎無表達(dá)，在第③組中呈顯著高表達(dá)趨勢而在第⑤組中僅有微弱的表達(dá)（P＜0.01），提示第③組BM-MSCs特異性向心肌樣細(xì)胞分化，而第⑤組BM-MSCs顯示出微弱的向心肌樣細(xì)胞分化的趨勢。我們于第15天時(shí)檢測GSK-3β表達(dá)量時(shí)發(fā)現(xiàn)第④⑤組中由于轉(zhuǎn)染目的基因的因素蛋白表達(dá)水平顯著高于其余三組，而在其余三組中第③組的GSK-3β僅有微弱的表達(dá)，第①②組顯著高于第③組（P＜0.

18、01）；鑒于非磷酸化β-catenin與磷酸化β-catenin的比值能夠反映Wnt信號(hào)通路的活化狀態(tài)，我們半定量檢測分析后發(fā)現(xiàn)第③組中非磷酸化β-catenin與磷酸化β-catenin比值均顯著高于其余四組（P＜0.01），此外第⑤組中的非磷酸化β-catenin與磷酸化β-catenin的比值略微高于第①②④組（P＜0.01），提示第③組中的Wnt信號(hào)通路明顯活化，而第⑤組中的Wnt信號(hào)通路亦有輕微激活的表現(xiàn)，可能的原因是第③組中

19、的miRNA-129針對(duì)復(fù)合抑制基團(tuán)主要成員GSK-3β有明顯的抑制作用，而當(dāng)?shù)冖萁M細(xì)胞外源性導(dǎo)入GSK-3β之后中和了miRNA-129針對(duì)GSK-3β的轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制結(jié)果，代償性的恢復(fù)對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制，因而表現(xiàn)出輕微的心肌樣分化表達(dá)。
　　結(jié)論：在沒有外源性誘導(dǎo)的情況下，過表達(dá)miRNA-129能夠顯著的促進(jìn)BM-MSCs向心肌樣細(xì)胞分化，分析其機(jī)制可能是通過抑制GSK-3β的表達(dá)，進(jìn)而穩(wěn)定維持β-catenin的非磷