小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞SCA-1+CD45+CD31+亞群向心肌樣細(xì)胞分化機(jī)制的實驗研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 促心肌分化基因篩選
　　目的:對SCA-1+CD45+CD31+、SCA-1+CD45+CD31-、SCA-1+CD45-CD31+、SCA-1+CD45-CD31-四個亞群基因芯片結(jié)果通過Real-timePCR篩選出在SCA-1+CD45+CD31+亞群表達(dá)最高的基因。
　　方法:根據(jù)基因芯片結(jié)果篩選出在SCA-1+CD45+CD31+亞群表達(dá)量最高的基因,包括myl3、

2、Itga4、Epor、Rock2、Cxadr、設(shè)計引物。提取SCA-1+CD45+CD31+、SCA-1+CD45+CD31-、SCA-1+CD45-CD31+、SCA-1+CD45-CD31-四組亞群細(xì)胞及未分選群細(xì)胞的RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行Real-timePCR檢測各基因在四組亞群及未分選群細(xì)胞中的表達(dá)量。
　　結(jié)果:經(jīng)Real-timePCR檢測,Itga4在未分選組中表達(dá)最高、Epor在SCA-1+CD45-CD

3、31+亞群中表達(dá)最高、Rock2在SCA-1+CD45-CD31-亞群中表達(dá)最高、Cxadr在SCA-1+CD45-CD31-亞群中表達(dá)最高,myl3在SCA-1+CD45+CD31+亞群中表達(dá)最高,且與其他亞群及未分選群比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論:myl3在SCA-1+CD45+CD31+亞群中表達(dá)量明顯高于其他三個亞群及未分選群。myl3為肌球蛋白輕鏈家族中一員,是肌小節(jié)粗肌絲的組成部分,屬于堿性輕鏈慢肌/心

4、室肌型,目前研究表明其在肌肉再生,促進(jìn)肌肉收縮方面有重要作用,而目前尚未有研究其在促進(jìn)心肌分化方面的作用。
　　第二部分 小鼠心梗模型的建立
　　目的:開胸直視下結(jié)扎小鼠冠狀動脈前降支,成功建立小鼠心肌梗死模型,進(jìn)行體內(nèi)實驗。
　　方法:24只雄性C57BL/6小鼠,體重在14-22g,分為心梗組(n=12),假開胸組(n=12),常規(guī)麻醉,固定小鼠,氣管切開插管,開胸,找到前降支,結(jié)扎,心梗建立成功,逐層關(guān)胸后拔氣管

5、插管。比較結(jié)扎前后心電圖,心超及組織學(xué)變化。
　　結(jié)果:結(jié)扎后心電圖導(dǎo)聯(lián)ST段明顯抬高,>0.2mv,術(shù)后四周心超提示心梗組EF和FS值較假開胸組明顯下降(P<0.05),左室舒張末期內(nèi)徑和左室收縮末期內(nèi)徑明顯增加(P<0.05),心臟HE染色證實建模成功。
　　結(jié)論:氣管插管開胸直視下行小鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)成功建立小鼠心梗模型。
　　第三部分 myl3促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的體外研究
　　

6、第一節(jié)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:從小鼠骨髓中分離出有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)。為進(jìn)一步的實驗研究提供可靠的細(xì)胞。
　　方法:小鼠全骨髓培養(yǎng)。流式鑒定細(xì)胞表面抗原表達(dá)。
　　結(jié)果:體外培養(yǎng)的原代MSCs10-14d達(dá)到融合,結(jié)果顯示超過90％小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞性表達(dá)CD29(細(xì)胞整合素分子)、CD90(粘附分子)和CD44

7、(粘附分子,介導(dǎo)細(xì)胞對透明質(zhì)酸和骨橋蛋白的粘附);但不表達(dá)造血祖細(xì)胞表面標(biāo)志 CD11b、CD133。
　　結(jié)論:利用MSCs貼壁特性,在體外條件下成功分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增了小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用于下面體內(nèi)體外研究。
　　第二節(jié)轉(zhuǎn)染myl3-siRNA檢測心肌特異性因子表達(dá)
　　目的:將合成的myl3-siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并檢測轉(zhuǎn)染后的心肌特異性因子的表達(dá)。
　　方法:利用lipofactamin

8、TM2000轉(zhuǎn)染試劑將合成好的myl3-siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為實驗組(A組),另將空白載體的siRNA轉(zhuǎn)進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為對照組(B組),24h倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)檢測轉(zhuǎn)染效率。并用心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)A組和B組向心肌樣細(xì)胞分化。48小時后收集細(xì)胞,設(shè)計myl3引物,Real-time PCR檢測其表達(dá)量。設(shè)計GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin引物,Real-timePCR檢

9、測心肌特異性因子在轉(zhuǎn)染后的表達(dá)。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染效率達(dá)60％以上。Real-time PCR檢測myl3表達(dá)量較對照組明顯下降。進(jìn)一步檢測心肌特異性因子GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin,與對照組比均下降。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建myl3-siRNA,轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后能下調(diào)心肌特異性因子。
　　第三節(jié)構(gòu)建過表達(dá)myl3質(zhì)粒
　　目的:構(gòu)建myl3過表達(dá)質(zhì)粒,并對構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒

10、定。
　　方法:從含有目的基因的質(zhì)粒克隆模板中,利用PCR方法釣取目的基因,若沒有模板則利用全基因合成的方法得到目的基因。將目的基因與目的載體分別進(jìn)行酶切。純化酶切產(chǎn)物后進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,對長出的克隆先進(jìn)行酶切鑒定,證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體。再對陽性克隆進(jìn)行測序和分析比對,比對正確的即為構(gòu)建成功的目的基因表達(dá)質(zhì)粒載體。將構(gòu)建好的過表達(dá)質(zhì)粒載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提。
　　結(jié)果:雙酶切鑒定及測序結(jié)果

11、證實過表達(dá)myl3質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　結(jié)論:成功的合成了myl3過表達(dá)質(zhì)粒,用于該基因的功能研究。
　　第四節(jié)轉(zhuǎn)染過表達(dá)myl3質(zhì)粒檢測心肌特異性因子表達(dá)
　　目的:將構(gòu)建好的過表達(dá)myl3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并檢測轉(zhuǎn)染后的心肌特異性因子的表達(dá)。
　　方法:利用lipofactaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑將合成好的過表達(dá)myl3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為實驗組(A組),并用同樣的方法將空白質(zhì)

12、粒轉(zhuǎn)進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為對照組(B組),小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為空白組(C組)。24h倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)檢測轉(zhuǎn)染效率。48小時后收集細(xì)胞,設(shè)計myl3引物, Real-time PCR檢測其表達(dá)量。用5-氮胞苷(10umol/L)對A組、B組細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo), C組不進(jìn)行誘導(dǎo),兩周后抽取RNA,行Real-time PCR檢測GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT的表達(dá)量。制備小鼠心肌細(xì)胞裂解液,對另一批A組、B組

13、細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),兩周后抽取RNA,行Real-time PCR檢測GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin的表達(dá)量。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染效率同樣在60％以上。Real-time PCR檢測myl3表達(dá)量較對照組明顯升高,經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)染了過表達(dá)myl3質(zhì)粒的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(A組)其心肌特異性因子GATA-4、Cx43、Nkx2.5的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(B組)升高,而A組和B組細(xì)胞較C

14、組比較上述心肌特異性因子的表達(dá)下降,而cTnT表達(dá)量在A組明顯高于B組和C組。重復(fù)上述實驗,結(jié)果同前。檢測經(jīng)心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)后的A、B、C組細(xì)胞心肌特異性因子GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT的表達(dá)量,我們發(fā)現(xiàn)A組>B組>C組,重復(fù)實驗結(jié)果同前。我們將經(jīng)心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)后多檢測的A、B、C組細(xì)胞各心肌特異性因子的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,A組的心肌特異性因子的表達(dá)較B組高且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),B組高于C組且有統(tǒng)計學(xué)

15、差異(P<0.05)。進(jìn)一步行免疫熒光檢測。
　　結(jié)論:myl3過表達(dá)后經(jīng)心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo),能促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化。
　　第五節(jié)心肌特異性因子的免疫熒光檢測
　　目的:從蛋白水平上進(jìn)一步驗證過表達(dá)myl3基因后小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌分化的能力
　　方法:利用lipofactaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑將合成好的過表達(dá)myl3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為實驗組(A組),并用同樣的方法

16、將空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為對照組(B組),制備小鼠心肌細(xì)胞裂解液,加入轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中,誘導(dǎo)向心肌細(xì)胞分化,兩周后行免疫熒光檢測。
　　結(jié)果:經(jīng)心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)14天后,過表達(dá)myl3的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)更多的心肌特異性因子Cx43,Desmin(圖中發(fā)紅光)。而轉(zhuǎn)染空白載體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞其心肌特異性因子Cx43,Desmin表達(dá)量明顯減少。
　　結(jié)論:從蛋白水平進(jìn)一步證實myl3過

17、表達(dá)后能更好促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化。
　　第四部分 myl3促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的體內(nèi)研究
　　目的:研究過表達(dá)myl3基因的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心梗的小鼠模型中是否能促進(jìn)其向心肌樣細(xì)胞分化,并改善心功能。
　　方法:選用雄性C57BL/6小鼠24只,體重在14-20g,氣管插管開胸直視下行冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù),建立小鼠心梗模型。小鼠隨機(jī)分為四組:轉(zhuǎn)染過表達(dá) myl3的BMSC組(A

18、組,n=6只),轉(zhuǎn)染空白載體組(B組,n=6只),BMSC組(C組,n=6只),PBS組(D組,n=6只)。將四組細(xì)胞分別注射進(jìn)小鼠心梗及周邊區(qū)域,手術(shù)當(dāng)天及四周后分別檢測心超,評估心功能,四周后處死小鼠,取心臟組織行組織學(xué)檢測。
　　結(jié)果:小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植四周后,進(jìn)行心超檢測,A組EF值較B、C、D組升高,但無統(tǒng)計學(xué)差異,(P>0.05),但比較BMSC移植前后EF值的差值,我們發(fā)現(xiàn)A組較其他各組明顯升高且有統(tǒng)計學(xué)差異(

19、P<0.05)。FS在注射干細(xì)胞前后的差值也在A組最高,且與其他三組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),A組的左室收縮末期容積和左室舒張末期容積在干細(xì)胞注射前后的差值也是最高,且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。心臟Masson染色測量心梗面積,提示A組心梗面積最小,纖維化程度最輕,且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。行心臟特異性抗原Cx43、desmin免疫組化檢測,兩種抗原在A組小鼠心臟中表達(dá)明顯,進(jìn)一步行免疫熒光檢測,過表達(dá)myl3的BMS