無血清和缺氧誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡及凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、心肌缺血后誘發(fā)的心肌細(xì)胞丟失以及內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制的缺乏是心力衰竭進(jìn)程中的關(guān)鍵誘導(dǎo)因素。控制心室重塑的發(fā)展從而逆轉(zhuǎn)心衰的進(jìn)程是醫(yī)學(xué)上急需解決的問題。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植因其可以有效地替換缺血后丟失的心肌細(xì)胞，改善心臟功能，而成為治療心肌缺血的新的希望。然而惡劣的缺血心臟微環(huán)境誘導(dǎo)移植細(xì)胞的大量丟失和細(xì)胞凋亡限制了細(xì)胞移植的治療效果。缺血環(huán)境中誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素以及細(xì)胞凋亡的詳盡的細(xì)胞信號(hào)機(jī)制尚不清楚。 本研

2、究從人胸骨骨髓以及大鼠腿骨骨髓中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以無血清和缺氧處理模擬體內(nèi)養(yǎng)分匱乏和低氧的缺血微環(huán)境，證實(shí)缺血可以誘導(dǎo)移植細(xì)胞的凋亡；比較系統(tǒng)地研究了該細(xì)胞凋亡的線粒體凋亡信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。另外，初步探討了線粒體的上游途徑，即細(xì)胞線粒體如何感受細(xì)胞外刺激的可能的信號(hào)機(jī)制。本論文旨在闡明缺血誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的細(xì)胞、分子機(jī)制，為細(xì)胞移植在臨床的應(yīng)用和研究提供新的突破口。 本研究主要包括以下的內(nèi)容：1、以percoll密度

3、梯度離心法從人的胸骨骨髓中分離人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以直接貼壁法從大鼠腿骨骨髓中分離出鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)所分離的細(xì)胞以及傳代后的細(xì)胞其表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45的分布與文獻(xiàn)中所描述間充質(zhì)干細(xì)胞的特征相一致。對(duì)所分離的細(xì)胞進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)和成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)，證明所得到的細(xì)胞具有多向分化潛能。由以上的證據(jù)證實(shí)所獲得的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2、利用體內(nèi)缺血的兩個(gè)主要的生理特征：生長(zhǎng)因子匱乏和缺氧

4、，建立了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清和缺氧聯(lián)合處理的體外模擬缺血模型。用Hoechst33342熒光核染色、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞大小變化和Annexin-ⅤFITC標(biāo)記等方法在該模型上證實(shí)缺血誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。化學(xué)生色底物法檢測(cè)到細(xì)胞凋亡后細(xì)胞Caspase-3、8、9的活性變化以及Westernblotting檢測(cè)到Caspase-3前體的酶解等凋亡相關(guān)事件。Caspase廣譜性抑制劑zVAD-fmk能夠完全抑制細(xì)胞的

5、凋亡，證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡依賴于Caspase信號(hào)途徑。Annexin-ⅤFITC標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析以及Caspase-3前體的酶解的結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)無血清刺激較缺氧刺激更為敏感，提示缺血心肌的相關(guān)生長(zhǎng)因子的匱乏對(duì)移植細(xì)胞生存有重要影響。 3、首次進(jìn)行了無血清和缺氧誘導(dǎo)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)途徑的研究。激光共聚焦、Westernblotting、流式細(xì)胞術(shù)和化學(xué)生色底物法分別證實(shí)缺血誘導(dǎo)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)

6、胞線粒體膜電位的下降、細(xì)胞色素C的釋放以及細(xì)胞Caspase-9的激活等凋亡相關(guān)事件。線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔PTP的抑制劑環(huán)胞菌素A(CsA)能夠完全抑制該細(xì)胞凋亡，說明無血清和缺氧誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體PTP依賴的凋亡途徑。Bcl-2家族蛋白Bax在細(xì)胞凋亡過程中由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞胞漿聚集到線粒體外膜，可能參與調(diào)控細(xì)胞凋亡線粒體信號(hào)傳遞。正常培養(yǎng)和凋亡的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的p53蛋白15號(hào)位絲氨酸均有較高水平的磷酸化，提示無血清和缺氧

7、誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡是p53蛋白非依賴的。 4、首次探討了Caspase-8在無血清和缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。盡管Westernblotting和化學(xué)生色底物法分別驗(yàn)證了細(xì)胞凋亡過程中死亡受體Fas及其配體Fas-L表達(dá)量的上升、Caspase-8活性的上升等反應(yīng)死亡受體激活的凋亡相關(guān)事件，但用Caspase-8特異性抑制劑zIETD-fmk完全抑制Caspase-8的酶活性后卻不能抑制細(xì)胞的凋亡，提示無血清和缺氧誘導(dǎo)

8、的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡是Caspase-8非依賴的。 5、初步研究了MAPK信號(hào)途徑在無血清和缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。Westernblotting檢測(cè)蛋白磷酸化水平的變化，以信號(hào)通路阻斷劑檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果顯示p38信號(hào)途徑部分參與了缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳遞；ERK1/2信號(hào)途徑參與了細(xì)胞對(duì)缺血刺激的應(yīng)答，卻沒有參與細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳遞；JNK在正常培養(yǎng)的細(xì)胞中就有較高水平的磷酸化，沒有參與細(xì)胞的凋亡過程。提示在細(xì)

9、胞外刺激向線粒體傳遞凋亡信號(hào)過程中，即線粒體的上游途徑可能與p38信號(hào)通路有關(guān)。 綜上所述，本文確認(rèn)了無血清和缺氧誘導(dǎo)移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，首次詳盡地描繪了無血清和缺氧刺激后細(xì)胞細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化；首次系統(tǒng)地研究了線粒體依賴的Caspase信號(hào)途徑在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡中的重要作用，提出線粒體功能損傷在該細(xì)胞凋亡過程中的中心地位，為尋找抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后凋亡的手段提供了潛在的靶點(diǎn)；初步探討了細(xì)胞外刺激向該細(xì)胞