溶血磷脂抗缺血誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、干細(xì)胞移植治療缺血性心肌病無論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是臨床實(shí)驗(yàn)均獲得了較大的進(jìn)展。然而，細(xì)胞移植后數(shù)小時(shí)內(nèi)大量的供體細(xì)胞死亡嚴(yán)重制約了細(xì)胞治療的療效。心肌缺血微環(huán)境誘導(dǎo)的凋亡性死亡被認(rèn)為是導(dǎo)致供體細(xì)胞大量丟失的一個(gè)主要因素。迄今為止，許多策略已經(jīng)被探索用于提高移植細(xì)胞的存活，然而，這些策略或因其自身不足不能很好的提高供體細(xì)胞存活或因使受體產(chǎn)生一定的毒副作用而限制了其臨床上的使用。 溶血磷脂(Lysophospholipids，LPs)是簡

2、單的磷脂類，最初作為細(xì)胞膜生物合成中的組分而被識(shí)別。研究表明，溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)和1—磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-Phosphate，SIP)作為溶血磷脂家族中兩個(gè)主要成員分別通過各自特異的G蛋白偶聯(lián)受體參與調(diào)節(jié)多種重要的生理以及病理生理學(xué)過程。本文前期的研究表明，LPA能夠拮抗缺氧無血清誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)凋亡，而LP

3、A是否體內(nèi)也有保護(hù)作用以及S1P作為LPA的同一個(gè)家族成員是否也能抗缺血誘導(dǎo)的MSC凋亡均不清楚。 MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的進(jìn)化上保守的非編碼的小RNA，其以一種翻譯抑制或mRNA降解的方式轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA在生物體發(fā)育、細(xì)胞的增殖與凋亡、細(xì)胞分化、腫瘤形成等一系列的生命活動(dòng)中均扮演著不可替代的角色。究竟miRNA在缺血誘導(dǎo)的MSCs凋亡的過程中扮演了怎樣的角色，其通過何種機(jī)制參與MSCs的凋亡均

4、未可知。 本論文首先致力于LPA對(duì)移植的MSCs的保護(hù)作用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的探討；同時(shí)對(duì)另一種更有臨床應(yīng)用前景的脂質(zhì)分子S1P對(duì)MSC的抗凋亡作用進(jìn)行體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)研究。另外，對(duì)miRNA在缺血誘導(dǎo)的MSCs凋亡中的作用進(jìn)行了初步研究。這些研究將有助于產(chǎn)生促進(jìn)供體細(xì)胞存活的治療新策略。 本研究包括以下3部分內(nèi)容： 1、雌性SD大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎建立心梗模型，然后被隨機(jī)分成3組，包括單純DMEM注射組(Group

5、l)，雄性MSCs注射組(Group2)和LPA預(yù)處理的雄性MSCs注射組(Group3)，細(xì)胞注射量為2×106。通過Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)SRY基因和TUNEL的方法評(píng)價(jià)移植細(xì)胞存活，結(jié)果表明LPA預(yù)處理提高了移植MSCs存活；而且免疫組化染色血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子—1表明移植LPA預(yù)處理的MSCs促進(jìn)了毛細(xì)血管的發(fā)生，同樣體外實(shí)驗(yàn)也表明LPA促進(jìn)了缺氧無血清條件下MSCs的VEGF分泌。超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心功能揭示了LPA預(yù)

6、處理的MSCs移植沒有獲得心功能的改善。以上數(shù)據(jù)表明，LPA預(yù)處理能夠提高移植MSCs存活，增強(qiáng)其旁分泌作用，促進(jìn)血管的發(fā)生，是一種有效地提高移植的MSC存活的策略。 2、通過建立的缺氧無血清誘導(dǎo)的大鼠MSCs凋亡模型來評(píng)價(jià)S1P的抗凋亡作用。結(jié)果顯示，S1P通過Gi蛋白偶聯(lián)SIP1受體以及下游的Akt和ERK1/2信號(hào)通路濃度依賴性的拮抗了缺氧無血清誘導(dǎo)的MSC凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法同LPA一致，結(jié)果表明：在細(xì)胞移植1小時(shí)、1天和

7、1周后，S1P處理組存活的MSCs明顯多于無S1P處理組存活的MSCs；移植S1P處理的MSCs在1周后促進(jìn)了心肌梗死區(qū)和周邊區(qū)血管的發(fā)生。另外，S1P促進(jìn)了缺氧無血清條件下VEGF的分泌，證明了其旁分泌作用的存在。以上數(shù)據(jù)表明，S1P處理MSCs是一種新的改善MSCs存活和促進(jìn)血管發(fā)生的治療策略。 3、對(duì)0小時(shí)、1.5小時(shí)、6小時(shí)缺氧無血清處理的MSC做miRNA芯片分析，結(jié)果表明，隨著時(shí)間進(jìn)程，miR—503等4個(gè)miRNA

8、表達(dá)逐漸升高；而miR—185等3個(gè)miRNA表達(dá)先升高再降低；miR—195等4個(gè)miRNA先降低再升高；miR—483等2個(gè)miRNA逐漸降低。Real-TimePCR的方法驗(yàn)證上述芯片結(jié)果表明miR—503等4個(gè)miRNA表達(dá)升高，其中miR—337是芯片結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)而本研究驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)了其表達(dá)的異常升高；miR—122a等3個(gè)miRNA表達(dá)降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)表明，miR—503和miR—337的上調(diào)以及miR—483的下調(diào)均具顯著性差異