FUT6在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究.pdf

1、目的：研究α-1,3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,3fucosyltransferase，F(xiàn)UT6）對TGF-β1誘導(dǎo)的人腎皮質(zhì)近曲腎小管上皮細(xì)胞（Human kidney-2,HK-2）在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）過程中的作用，探討2型糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)患者早期TGF-β/Smad信號通路激活的可能分子機(jī)制，為尋找與DN相關(guān)的致病基

2、因、了解DN的遺傳背景提供依據(jù)。
　　方法：（1）選取早期出現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路高表達(dá)的2型糖尿病腎病患者作為研究對象，提取患者外周血全基因組 DNA，純化后華大基因 Illumina HiSeq2000高通量測序平臺測序。（2）分析處理外顯子測序信息，對所得變異進(jìn)行注釋，并與公共數(shù)據(jù)庫YH、dbSNP129、8HapMapexome和thousands genome進(jìn)行比對過濾，篩除已報(bào)道的基因多態(tài)性位點(diǎn)。對發(fā)生無義突

3、變基因的功能及在腎臟的表達(dá)情況進(jìn)行生物信息學(xué)分析。（3）根據(jù)患病基因的突變頻數(shù)、檢測SNP位點(diǎn)的質(zhì)量值、是否在腎臟表達(dá)及基因功能分析，選取FUT6作為研究對象。對該 DN患者的活檢腎組織進(jìn)行 SP(過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素)法免疫組織化學(xué)染色，了解目的基因 FUT6的表達(dá)情況。（4）用熒光標(biāo)記的siRNA（Cy3-siRNA）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HK-2細(xì)胞，倒置顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率，Western blot檢測FUT6基因的沉默效率。（5）為研

4、究FUT6-siRNA干擾對EMT的影響，實(shí)驗(yàn)分為以下幾組：①正常對照組（NC組），常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞；②TGF-β1刺激組（TGF組），TGF-β110ng/ml刺激細(xì)胞48小時(shí)；③FUT6-siRNA干擾組（RNAi組），使用 FUT6-siRNA50nM瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，沉默 HK-2細(xì)胞 FUT6的表達(dá)；④FUT6-siRNA干擾+TGF-β1刺激組（iTGF組），使用FUT6-siRNA50nM瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞沉默F(xiàn)UT6基因表達(dá)，隨后加入

5、TGF-β110ng/ml刺激細(xì)胞48小時(shí)。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；Western blot檢測FUT6蛋白的表達(dá)情況，及各組TGF-β/Smad信號系統(tǒng)（TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2/3和p-Smad2/3）的表達(dá)；Western blot檢測EMT相關(guān)指標(biāo)（E-cadherin、N-cadherin、Snail和Vemintin）的表達(dá)；另外用免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）結(jié)合凝集素印跡

6、（Lectin blotting analysis,IB）特異性檢測結(jié)合在TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ上的巖藻糖鏈的表達(dá)。（6）TGF-β1刺激不同時(shí)間的研究：TGF-β110ng/ml分別刺激細(xì)胞1d、2d和3d，分別標(biāo)記TGF D1組、D2組和D3組。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；Western blot檢測各組細(xì)胞 FUT6、TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ的表達(dá)量的變化；IP結(jié)合IB特異性檢測結(jié)合在TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ上

7、的巖藻糖鏈的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）外顯子組測序發(fā)現(xiàn)單核苷酸變異總共38914個(gè)。通過與公共數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)的比對過濾，共發(fā)現(xiàn)509個(gè)突變位點(diǎn)，其中包括497個(gè)錯(cuò)義突變和12個(gè)無義突變。發(fā)生無義突變且在腎臟高表達(dá)的基因有ANKRD35、ACSM2A、FUT6和HAAO。其中 FUT6基因的315TAC>TAA，氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，免疫組化證實(shí)FUT6在該患者的腎活檢組織中表達(dá)量減少。（2）熒光顯微鏡和Western blo

8、t檢測結(jié)果顯示FUT6-siRNA在50nM和100nM濃度時(shí)均可成功干擾HK-2細(xì)胞FUT6表達(dá)，沉默效率約為50％。（3）相差顯微鏡觀察NC組細(xì)胞呈正常上皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)；TGF組細(xì)胞肥大、拉長，呈梭形改變；RNAi組與NC組細(xì)胞相比，形態(tài)幾乎未發(fā)生變化；iTGF組細(xì)胞形態(tài)部分發(fā)生梭形改變，但與 TGF組細(xì)胞相比 TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)的梭形改變較不明顯。（4） Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比RNAi組FUT6

9、的表達(dá)減少，而TGF組和iTGF組FUT6的表達(dá)量增加，說明TGF-β1刺激下FUT6的表達(dá)量增加，而siRNA干擾并不能抑制TGF-β1刺激引起的FUT6表達(dá)量的增加。TGF組、RNAi組和iTGF組p-Smad2/3的表達(dá)與NC組相比明顯增加；RNAi組和iTGF組Smad2/3的表達(dá)增高，而TGF組表達(dá)幾乎不發(fā)生變化。TGF組Snail、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)與NC組相比升高，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，提

10、示HK-2細(xì)胞發(fā)生成纖維化轉(zhuǎn)變；RNAi組Snail、 E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)幾乎未發(fā)生改變；iTGF組與TGF組相比，E-cadherin的表達(dá)未發(fā)生改變，而Snail、Vimentin和N-cadherin表達(dá)明顯減少，說明用 FUT6-siRNA干擾其表達(dá)后，能一定程度抑制 TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。（5）IP結(jié)合凝集素印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示特異性結(jié)合在TGF-βRⅠ的巖藻糖基鏈的表達(dá)，TGF

11、組與 NC組相比基本保持不變，而 RNAi組和iTGF組與 TGF組相比表達(dá)明顯下調(diào)；其變化趨勢與特異性結(jié)合在TGF-βRⅡ上的巖藻糖鏈的變化相同。（6）TGF-β1處理不同時(shí)間相差顯微鏡觀察，隨著刺激時(shí)間的延長細(xì)胞形態(tài)發(fā)生梭形改變的趨勢越明顯；FUT6的表達(dá)先增加后減少，其變化趨勢同TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ；IP結(jié)合IB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TGF-β1處理不同時(shí)間，特異性結(jié)合在 TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ上的巖藻糖鏈的表達(dá)并未發(fā)生改