Notch通路在TGF-β1誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、目的:
　　 上皮性卵巢癌為最常見的卵巢惡性腫瘤，其死亡率居婦科惡性腫瘤首位。卵巢癌早期不易發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)癥狀多屬晚期（Ⅲ-Ⅳ期），存在廣泛轉(zhuǎn)移。雖經(jīng)過規(guī)范化治療包括理想的腫瘤細胞減滅術(shù)和以鉑類和/或紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，上皮性卵巢癌的5年生存率仍徘徊在30％-40％。卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生和對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成其高死亡率的兩個關(guān)鍵因素。
　　 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransi

2、tion，EMT)是一個高度保守的細胞程序，是指上皮細胞失去上皮特性獲得間質(zhì)細胞表型的一種生物學現(xiàn)象。它不僅是哺乳動物胚胎發(fā)育和器官形成的基礎(chǔ)過程，還是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。并且越來越多的研究表明，腫瘤細胞經(jīng)過EMT，可以獲得多向分化等干細胞樣特性，與腫瘤對化療藥物產(chǎn)生耐藥相關(guān)。因此通過各種技術(shù)和策略干擾腫瘤細胞的EMT過程有望為癌癥治療提供一個新途徑，但這有賴于對EMT分子調(diào)控機制以及腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的進一步認識。

3、　　 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)是一種分泌型的多肽信號分子，在多種腫瘤組織中呈高表達，其作為EMT的一個重要誘導(dǎo)因子，以自分泌和旁分泌的形式作用于腫瘤細胞，誘導(dǎo)和維持細胞的EMT。研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)細胞發(fā)生完全EMT轉(zhuǎn)換過程中，TGF-β需要干細胞信號通路如Notch，Wnt/β-catenin，Ras，Hedgehog等的介導(dǎo)，這種現(xiàn)象的存在進一步提示了EMT與腫瘤干細胞之間的某

4、種關(guān)聯(lián)性。但信號通路之間的串話具有環(huán)境依賴性，該現(xiàn)象在上皮性卵巢癌中的存在性和存在形式仍需要進一步研究的證實。
　　 本實驗通過體外培養(yǎng)人卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3，以TGF-β1和Notch信號通路抑制劑DAPT作為處理因素，旨在研究Notch信號通路在TGF-β1誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細胞發(fā)生EMT過程中的作用，并對其作用機制進行探索，以期為上皮性卵巢癌的治療提供新的思路和實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 常規(guī)

5、培養(yǎng)人卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3，待細胞進入對數(shù)生長期，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基同步化24h后，按加入刺激的不同分為空白對照組，TGF-β1組(10ng/ml)，DAPT組(Notch信號通路的抑制劑，10uM)，TGF-β1和DAPT聯(lián)合處理組(10ng/mlTGF-β1，10uMDAPT)，不同刺激均作用72h。
　　 1、倒置顯微鏡:應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。
　　 2、蛋白質(zhì)印跡（Westernblotti

6、ng）:應(yīng)用Westernblotting檢測上皮細胞標記物E-cadherin，間質(zhì)細胞標記物N-cadherin、Vimentin，Notch信號通路的激活形式NICD以及Notch信號通路的配體Jagged1的表達情況。
　　 3、細胞劃痕試驗:應(yīng)用劃痕試驗評估細胞的遷移能力，常規(guī)培養(yǎng)SKOV3細胞，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基同步24h后，先按照分組加入不同刺激作用48h后再做劃痕，劃痕時理想的細胞密度為形成細胞單層，觀察劃痕24h

7、后不同組間劃痕愈合情況的不同。
　　 4、實時熒光定量PCR:待加入TGF-β1刺激48h和72h后提取細胞的總RNA，檢測Jagged1mRNA的表達量。
　　 5、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、倒置相差顯微鏡下觀察正常培養(yǎng)的SKOV3細胞形態(tài)為典型的鋪路石樣，細胞排列規(guī)則緊湊，在TGF-β1作用72h后，細胞轉(zhuǎn)換成紡錘體形，形成明顯的細胞偽足，且細胞排列變松散;在

8、DAPT處理組、TGF-β1和DAPT聯(lián)合處理組，細胞形態(tài)均沒有明顯變化。
　　 2、Westernblotting結(jié)果:
　　 (1)經(jīng)10ng/ml的TGF-β1作用72h后，SKOV3細胞上皮細胞標記物E-cadherin（0.632±0.129）表達較對照組(1.000±0.000)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;而間質(zhì)細胞標記物Vimentin和N-cadherin（3.067±2.394、1.31

9、9±0.243）表達升高，與對照組相比(1.000±0.000、1.000±0.001)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);TGF-β1和DAPT聯(lián)合處理組細胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表達相對于對照組分別為(0.961±0.224、1.548±1.015、1.181±0.223)，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義;
　　 (2)與對照組相比(1.000±0.002)，TGF-β1組細胞Notch

10、信號通路的激活形式NICD的表達升高(1.453±0.379)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而TGF-β1和DAPT聯(lián)合處理組細胞NICD的相對表達量為(0.540±0.318)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義;
　　 (3)與對照組相比(1.000±0.003)，TGF-β1組細胞Jagged1的表達明顯升高(1.514±0.151)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、劃痕試驗結(jié)果顯示，劃痕24h后，

11、TGF-β1組[(24980.18±1171.20)um2]劃痕愈合面積明顯大于對照組[(19758.01±2534.50)um2]，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而TGF-β1和DAPT聯(lián)合處理組[(17703.40±1519.27)um2]劃痕愈合面積較對照組和TGF-β1組均變小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 4、RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1作用48h和72h后，Jagged1的mRNA表達量分別為