Sohlh2通過(guò)下調(diào)HIF1α抑制缺氧誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變.pdf

1、研究背景:在所有婦科相關(guān)腫瘤類型引起的致死病因中，卵巢癌位于第一位。正常卵巢位于女性盆腔深處，臨床上早期篩查手段效率低，卵巢癌患者確診腫瘤時(shí)，多數(shù)已處于臨床晚期，故5年存活率常低于30％。上皮性卵巢癌作為卵巢癌中最常見(jiàn)的一種類型，多在臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)，已浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移至盆腔或腹腔其他部位，因此現(xiàn)如今常規(guī)的治療手段，如手術(shù)切除治療、化療或放療，效果并不理想。因此闡明上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機(jī)制，尤其是探討上皮性卵巢癌遠(yuǎn)處浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于上皮性卵

2、巢癌的早期診斷以及治療有指導(dǎo)性意義。
　　缺氧是公認(rèn)的腫瘤所處的微環(huán)境，是由于腫瘤細(xì)胞的無(wú)節(jié)制增長(zhǎng)導(dǎo)致組織缺氧，進(jìn)而形成一個(gè)酸性的腫瘤微環(huán)境。尤其在實(shí)體腫瘤結(jié)構(gòu)中，缺氧部位可橫穿整個(gè)腫瘤組織。文獻(xiàn)報(bào)道，缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor，HIF)是缺氧誘導(dǎo)的重要分子，HIF可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變和遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移。其中，缺氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia inducible factor1α，HIF1

3、α）調(diào)控腫瘤酸性微環(huán)境中碳酸酐酶9(Carbonic anhydrase，CA9)的表達(dá)，通過(guò)調(diào)控CO2水和反應(yīng)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)外pH值，使得腫瘤細(xì)胞能夠適應(yīng)缺氧和缺氧所導(dǎo)致的酸性環(huán)境，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。
　　上皮-間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）進(jìn)程對(duì)于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及后期進(jìn)展的作用十分重要，其中就包括上皮性卵巢癌細(xì)胞。EMT可賦予上皮細(xì)胞間質(zhì)細(xì)

4、胞表型，導(dǎo)致細(xì)胞之間的粘附性降低、能動(dòng)性增高，從而獲得侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。而缺氧環(huán)境可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT。抑制缺氧誘導(dǎo)的EMT可能是抑制腫瘤侵襲遷移的重要機(jī)制。
　　Sohlh2(Spermatogenesis and oogenesis basic helix-loop-helix(bHLH) transcription factor2)是bHLH家族的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，Sohlh2在卵巢表面上皮

5、和輸卵管上皮中表達(dá)較高，但其在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)水平則明顯降低。過(guò)表達(dá)Sohlh2，可通過(guò)調(diào)控不同分子機(jī)制抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這一結(jié)果表明Sohlh2是一個(gè)新的抑癌基因。另外，最新研究發(fā)現(xiàn)Sohlh2可通過(guò)下調(diào)IL-8抑制人乳腺癌細(xì)胞的EMT。但是，Sohlh2對(duì)于缺氧誘導(dǎo)的上皮性卵巢癌EMT的作用及作用機(jī)制需進(jìn)一步探討。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)上皮性卵巢癌細(xì)胞，利用化學(xué)乏氧劑氯化鈷，模擬腫瘤細(xì)胞所處的缺氧

6、微環(huán)境;通過(guò)Sohlh2基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾，利用劃痕、Transwell遷移、Matrigel侵襲、免疫熒光染色、Western Blot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)Sohlh2在缺氧引起的上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT及侵襲遷移中的作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，以期可以為臨床上該類腫瘤的治療發(fā)現(xiàn)新的方向。
　　方法:
　　1.檢測(cè)Sohlh2在缺氧狀態(tài)下對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲的影響。體外培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細(xì)胞株H08910和SKOV3，

7、采用基因轉(zhuǎn)染及RNA干擾技術(shù)，過(guò)表達(dá)或敲減Sohlh2基因。將細(xì)胞分為以下幾組:①H08910-pEGFP組;②H08910-pSohlh2組;③SKOV3-Con組;④SKOV3-pShSohlh2組，①②組細(xì)胞通過(guò)G418篩選，③④組細(xì)胞通過(guò)puromycin篩選，篩選時(shí)間為兩周，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)的Sohlh2過(guò)表達(dá)以及Sohlh2敲減細(xì)胞系。四組細(xì)胞中加入100μM CoCl2缺氧處理48h。采用劃痕、Transwell遷移、Matrig

8、el侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Sohlh2在缺氧狀態(tài)的上皮性卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用。
　　2.檢測(cè)Sohlh2對(duì)缺氧誘導(dǎo)的上皮性卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變過(guò)程的作用。采用Western Blot技術(shù)，檢測(cè)H08910-pEGFP組、H08910-pSohlh2組、SKOV3-Con組、SKOV3-pShSohlh2組細(xì)胞經(jīng)過(guò)100μ M CoCl2缺氧處理48h后，上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin、N-cadher

9、in和Sohlh2蛋白表達(dá)水平的變化;采用免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)H08910-pEGFP組和H08910-pSohlh2組細(xì)胞經(jīng)過(guò)缺氧處理后E-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平的變化。
　　3.探討Sohlh2在缺氧誘導(dǎo)的上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT中的作用機(jī)制。
　　將H08910-pEGFP組、H08910-pSohlh2組、SKOV3-Con組、SKOV3-pShSohlh2組細(xì)胞分別在正常氧氣含量(25％ O2

10、)及缺氧狀態(tài)(100μ M CoCl2)下進(jìn)行培養(yǎng)，采用Western Blot技術(shù)，檢測(cè)HIF1α和CA9的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過(guò)缺氧處理48h后，與H08910-pEGFP組相比，H08910-pSohlh2組48小時(shí)細(xì)胞遷移的距離明顯縮短(P＜0.05);Transwell遷移和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:H08910-pSohlh2組遷移、侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)。
　　經(jīng)過(guò)

11、缺氧處理48h后，與SKOV3-Con組相比，SKOV3-pShSohlh2組48小時(shí)細(xì)胞遷移的距離明顯增加(P＜0.05); Transwell遷移和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:SKOV3-pShSohlh2組遷移、侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.05)。
　　2.免疫熒光結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)缺氧處理48h后，與H08910-pEGFP組相比，H08910-pSohlh2組上皮性標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增加，Vime

12、ntin蛋白表達(dá)降低。
　　3.經(jīng)過(guò)缺氧處理后，與H08910-pEGFP組對(duì)比，上皮性標(biāo)志物蛋白E-cadherin表達(dá)明顯升高，間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低;與SKOV3-Con組相比，SKOV3-pShSohlh2組上皮性標(biāo)志物蛋白E-cadherin表達(dá)明顯減少，Vimentin和N-cadherin表達(dá)升高。
　　4.在正常氧氣含量及缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)H08910-pEGFP組和H

13、08910-pSohlh2組細(xì)胞，缺氧狀態(tài)下H08910細(xì)胞HIF1α和CA9的蛋白表達(dá)明顯高于正常氧氣含量培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白表達(dá)量;在正常氧氣含量和缺氧狀態(tài)下，與H08910-pEGFP組對(duì)比，H08910-pSohlh2組HIF1α和CA9的蛋白表達(dá)量均明顯降低。
　　在正常氧氣含量及缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)SKOV3-Con組和SKOV3-pShSohlh2組，缺氧狀態(tài)下SKOV3細(xì)胞HIF1α和CA9的蛋白表達(dá)量較正常氧氣含量培養(yǎng)細(xì)胞的