Rac1調(diào)控香煙誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞—間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變.pdf

1、研究背景和研究目的:肺癌和慢性阻塞性肺炎(COPD)是影響人類(lèi)生活質(zhì)量的全球性健康問(wèn)題，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)，上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(EMT)是COPD和肺癌的重要病理生理過(guò)程。我們推測(cè)吸煙可能是引起EMT的重要因素。香煙含有大量的氧化物質(zhì)，這些氧化物質(zhì)能激活Rac1。Rac1是Rho家族中的一種小G蛋白，其影響細(xì)胞的生存、遷移、骨架重排和代謝，并且Rac1的敲除能夠有效地抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。雖然有研究證明Rho信號(hào)途徑在TGF-

2、β1所誘導(dǎo)的遷移中的作用，以及Smad信號(hào)在EMT的調(diào)控作用，但是有關(guān)Rac1在香煙誘導(dǎo)的EMT中的調(diào)節(jié)作用，則尚未見(jiàn)有報(bào)道。因此，本課題就香煙能否誘導(dǎo)EMT及誘導(dǎo)過(guò)程的關(guān)鍵因子和信號(hào)途徑加以研究。
　　 方法:
　　 1) MTT法檢測(cè)CSE對(duì)A549細(xì)胞活性的影響;
　　 2)用CSE誘導(dǎo)EMT，用Q-PCR、Elisa、western blot、細(xì)胞免疫熒光染色等方法測(cè)定EMT指標(biāo)如轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(TGF-β

3、1)、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)、α-肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白(vimentin)，和顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞形態(tài);
　　 3)用抗TGF-β1中和抗體(ATNA)阻斷TGF-β1與其Ⅱ型受體相結(jié)合，確認(rèn)TGF-β信號(hào)通路在CSE誘導(dǎo)的EMT中的作用;
　　 4)采用Rac活性試驗(yàn)檢測(cè)CSE對(duì)Rac1信號(hào)分子的影響，接下來(lái)用Rac1的抑制劑(NSC23766，NSC)抑制Rac1

4、的活性或Rac1 siRNA沉默Rac1基因，來(lái)探究Rac1在CSE誘導(dǎo)的EMT中的作用;
　　 5) NSC抑制Rac1的活性或Rac1 siRNA沉默Rac1基因后，采用westem blot法來(lái)檢測(cè)Rac1對(duì)CSE誘導(dǎo)的Akt、Smad2以及P38活性的影響;
　　 6)用PI3K的抑制劑(LY294002)和Akt的抑制劑(MK-2206)分別抑制PI3K和Akt的活性以及Erk1/2抑制劑(U0126)、JNK

5、抑制劑(SP600125)、p38抑制劑(SB203580)阻斷Erk1/2、JNK和P38，進(jìn)一步研究CSE誘導(dǎo)EMT的信號(hào)機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1)細(xì)胞活力檢測(cè):不同濃度的CSE(0.1％～3％)與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549)培養(yǎng)24、48、72小時(shí)，呈濃度和時(shí)間依賴(lài)引起A549細(xì)胞毒反應(yīng)和減少細(xì)胞的存活率;
　　 2) CSE誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞TGF-β1的表達(dá):不同濃度的CSE(0.1％～2.5％)刺激

6、A549細(xì)胞24、48、72小時(shí)，Q-PCR和Elisa檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CSE呈濃度和時(shí)間依賴(lài)誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1，CSE暴露刺激48小時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、EMT相關(guān)因子的表達(dá)變化，并且低濃度的CSE和低濃度的TGF-β1聯(lián)合處理細(xì)胞時(shí)可以協(xié)同誘導(dǎo)EMT現(xiàn)象;
　　 3)用ATNA阻斷TGF-β1與其Ⅱ型受體相結(jié)合，能抑制CSE誘導(dǎo)的EMT相關(guān)因子的表達(dá)變化（抑制E-cadherin表達(dá)的下調(diào)以及TGF-β1、vime

7、ntin、α-SMA表達(dá)的上調(diào)），這些數(shù)據(jù)證實(shí)CSE誘導(dǎo)EMT通過(guò)TGF-β1的聚集及其下游信號(hào)通路的激活;
　　 4) ATNA/NSC可阻斷CSE誘導(dǎo)的Rac1的激活，這顯示CSE激活Rac1依賴(lài)于TGF-β1的聚集，并且抑制Rac1的活性或其表達(dá)可顯著抑制CSE誘導(dǎo)的EMT現(xiàn)象;
　　 5) CSE呈濃度依賴(lài)性誘導(dǎo)Akt的磷酸化，抑制Rac1活性或者其表達(dá)可抑制CSE誘導(dǎo)的Akt、Smad2的激活，但對(duì)P38的磷酸

8、化無(wú)明顯影響。PI3K和Akt的抑制劑能顯著抑制EMT相關(guān)因子的表達(dá)變化，而MEK、P38、JNK抑制劑不能抑制這種現(xiàn)象。
　　 結(jié)論:
　　 綜上結(jié)果提示，CSE刺激人的肺上皮細(xì)胞可引起EMT形態(tài)學(xué)和相關(guān)因子的變化與增加TGF-β1表達(dá)直接相關(guān)，siRac1干預(yù)和Rac1抑制劑處理可減少TGF-β1表達(dá)，也能抑制Akt、Smad信號(hào)途徑，提示Akt/Smad2是Rac1的下游分子。我們的研究表明Rac1可能是治療COP