Snail在上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及對ZEB1調(diào)控的研究.pdf

1、腫瘤進(jìn)展過程中常見的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是一個(gè)復(fù)雜的逐步發(fā)生的現(xiàn)象，它最主要的標(biāo)志是E-cadherin的缺失。多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表現(xiàn)出對E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制，包括鋅指蛋白Snail、Slug、Twist、ZEB1、ZEB2和E12/E47。研究發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)錄因子之間可以相互作用，直接激活下游轉(zhuǎn)錄因子的啟動序列，共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變。在果蠅體中，Sna

2、il通過抑制shotgun（E-cadherin的同源物）調(diào)控胚胎發(fā)育，Snail家族的羧基末端高度保守，介導(dǎo)序列特異性與含有E-box(CAGGTG)的DNA啟動子相互作用，這是其參與EMT的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子ZEB家族結(jié)構(gòu)中均包含2個(gè)鋅指簇和連接這兩個(gè)鋅指簇的可變序列。ZEB1雙側(cè)的鋅指簇必須同時(shí)與包含CACCT(G)或CAGGTG(E盒)序列的DNA結(jié)合才能發(fā)揮調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的功能。ZEB1可以與E-cadherin

3、編碼基因啟動子上的E2盒[CACCT(G)]結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT。研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤細(xì)胞EMT過程中存在Sulg對ZEB1的直接調(diào)節(jié)，在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的EMT過程中Snail2可以直接激活Twistl的轉(zhuǎn)錄，EMT過程中轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用使細(xì)胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)更為復(fù)雜。
　　 試驗(yàn)首先篩選高表達(dá)Snail的細(xì)胞系提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因Snail。試

4、驗(yàn)中采用TA克隆技術(shù)大量擴(kuò)增目的基因，應(yīng)用相同限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別切割pEASY-T1-Snaill和質(zhì)粒pcDNA3.1使其產(chǎn)生相同的粘性末端，用T4DNA連接酶將目的基因與表達(dá)載體連接，待測序結(jié)果證實(shí)目的基因序列正確后，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌大量抽提質(zhì)粒pcDNA3.1-Snail。利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Snail，使Snail在A549肺癌細(xì)胞中高表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)倒置顯微鏡下A549細(xì)胞的形態(tài)更具間質(zhì)性

5、狀，細(xì)胞長梭形，分散存在;劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與空白組和對照組相比pcDNA3.1-Snail組細(xì)胞愈合速度較快;Western Blotting結(jié)果示E-cadherin表達(dá)減少，而間質(zhì)性蛋白N-cadherin，F(xiàn)ibronectin表達(dá)上調(diào)。為增強(qiáng)試驗(yàn)說服力，我們在被5ng/ml的TGF-β作用48小時(shí)誘導(dǎo)為間質(zhì)狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞中感染病毒LV-Snail-RNAi后，發(fā)現(xiàn)敲除Snail后，高表達(dá)的N-cadherin和Fibronectin

6、表達(dá)下調(diào)，而上皮性蛋白E-cadherin被逆轉(zhuǎn)上調(diào)。說明Snail能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變，而抑制Snail的表達(dá)有可能會阻止或減緩腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 在研究轉(zhuǎn)錄因子Snail和ZEB1的調(diào)控關(guān)系時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞系中高表達(dá)Snail后轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達(dá)隨之升高，在被TGF-β誘導(dǎo)為間質(zhì)狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞中敲除Snail后，被誘導(dǎo)上調(diào)的ZEB1又隨之下降。反之，ZEB1并未明顯改變Snail的表達(dá)情況。初