SIRT1對肺炎鏈球菌感染肺上皮細胞誘導LL-37表達的調(diào)控作用及機制.pdf

1、目的：
　　1.研究肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）誘導人肺泡Ⅱ型上皮細胞來源肺腺癌上皮細胞系A(chǔ)549和人支氣管上皮細胞BEAS-2B細胞LL-37的表達水平。
　　2.探討沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(Sirtuin1，SIRT1)對SP誘導A549和BEAS-2B細胞LL-37表達的調(diào)節(jié)及機制。
　　方法：
　　A549和BEAS-2B細胞（購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫）傳

2、代后接種于培養(yǎng)瓶或6孔板，細胞以含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待生長約70％～80％滿皿底面積時，建立細胞SP(ATCC6303)感染模型，細菌感染前24h換用無雙抗RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。奧普托欣敏感性檢測菌株抑菌環(huán)直徑大小。
　　1.SP感染后細胞活力變化測定
　　將不同感染分數(shù)（MOI分別為0、1、20、50）的SP感染A549和BEAS-2B細胞，于感染6h終止感染，LDH細胞毒性試驗檢測細胞

3、活力;SP(MOI20)感染A549和BEAS-2B細胞，分別于感染后0h、6h、12h、24h終止感染，LDH細胞毒性試驗檢測細胞活力。
　　2.不同感染分數(shù)和感染時間的SP誘導肺上皮細胞LL-37的表達水平測定
　　將不同感染分數(shù)（MOI分別為0、1、20、50）的SP感染A549和BEAS-2B細胞，于感染6h終止感染;SP(MOI20)感染A549細胞，分別于感染后0h、6h、12h、15、24h終止感染，采用qRT

4、-PCR檢測LL-37 mRNA表達水平，ELISA檢測LL-37蛋白水平。
　　3.RNAi技術(shù)及沉默效果檢測
　　A549細胞以3～4×105/ml密度接種于6孔板，用不含雙抗RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，待細胞生長至30％～50％滿皿底面積時，進行如下分組。對照組:除培養(yǎng)基以外不加其他試劑;si-SIRT1序列①組:培養(yǎng)基加轉(zhuǎn)染si-SIRT1序列①;si-SIRT1序列②組:培養(yǎng)基加轉(zhuǎn)染si-SIRT1序列②;陰性

5、對照siRNA(siRNA-NC)組:培養(yǎng)基加轉(zhuǎn)染無意義siRNA; lipo組:培養(yǎng)基加lipofectaminTM2000試劑，行qRT-PCR、Western Blot檢測siRNA沉默效果。
　　4.SIRT1對SP誘導的A549和BEAS-2B細胞LL-37表達的調(diào)節(jié)作用測定
　　6孔板或培養(yǎng)瓶中的A549和BEAS-2B細胞生長至約30％～50％滿皿底面積時，按組別分別予細胞轉(zhuǎn)染處理72h，SRT1720（SIR

6、T1激動劑）干預細胞后，加入新鮮無雙抗培養(yǎng)液孵育。向?qū)φ战M以外各孔加入MOI20的SP菌懸液，于感染6h后終止感染。實驗分組為:對照組（PBS預處理細胞）、SP組:（SP感染組）、SRT1720+SP組（25 umol/L的SRT1720預孵育24h+SP感染）、si-SIRT1+SP組（si-SIRT1序列②75nmol/L轉(zhuǎn)染72h+SP感染）、DMSO+SP組（DMSO25 umol/L預孵育24h+SP感染）。利用LDH細胞毒性

7、試驗檢測細胞活力，qRT-PCR檢測SIRT1、LL-37 mRNA，ELISA檢測LL-37和IL-8蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1.A549和BEAS-2B細胞形態(tài)觀察
　　光鏡下，A549和BEAS-2B細胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形或扁平狀多角形等多種形態(tài)，胞體飽滿，折光性強，核仁多個。SP感染(MOI20)24h后，細胞回縮稀疏，排列紊亂，胞間空隙變大，空泡增多，核漿比減小，折光性減弱。
　　2.奧普托欣實驗

8、r>　　細菌置35℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育18～24h后，測量菌株抑菌環(huán)直徑＞14mm，證實培養(yǎng)菌株為SP。
　　3.SP以MOI和感染時間依賴性方式影響A549和BEAS-2B細胞活性
　　細胞毒性隨著MOI增加而升高，感染6h時，MOI20組和MOI50組與對照組(MOI0)相比，差異均有顯著性差異（分別為P＜0.05，P＜0.01;P＜0.01，P＜0.01）。隨著感染時間增加，細胞活性下降。MOI為20時，感染6h、

9、12h、24h后細胞毒性較對照組(0h)顯著增高(分別為P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)。
　　4.SP感染誘導A549和BEAS-2B細胞表達LL-37
　　4.1不同MOISP感染后A549和BEAS-2B細胞的LL-37表達變化
　　SP感染A549和BEAS-2B細胞6h后，LL-37表達隨著MOI增加而不同。LL-37mRNA在MOI為20時表達較對照組(MOI0)顯著增加(P＜0.01，P＜0.0

10、5)，MOI50組較對照組顯著下降（均P＜0.01）。未感染狀態(tài)下，A549細胞LL-37蛋白表達較BEAS-2B細胞低，分別為17.65±0.66 pg/ml，21.11±1.50pg/ml，差異有顯著性（t=-3.668，P＜0.05）;MOI為20時， A549和BEAS-2B細胞的LL-37蛋白表達均較對照組顯著增高（P＜0.05，P＜0.01），但A549細胞LL-37蛋白表達仍低于BEAS-2B細胞，分別為19.60±0.8

11、2 pg/ml，38.31±2.66 pg/ml，差異有顯著性(t=-11.604，P＜0.01);兩種細胞MOI20組LL-37的mRNA和蛋白水平明顯高于MOI50組，差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.05; P＜0.01, P＜0.01)。
　　4.2 A549和BEAS-2B細胞的LL-37表達隨SP感染時間變化
　　MOI為20，SP感染6h、12h后，A549細胞的LL-37 mRNA表達量較對照組(0h)增高

12、，有顯著性差異（均P＜0.01）;感染15h較對照組顯著下降(P＜0.01);與對照組比較，BEAS-2B細胞經(jīng)SP感染6h、12h后，LL-37 mRNA表達量顯著增高（均P＜0.01），達3～4倍;15h組表達量與對照組無顯著性差異(P＞0.05)，較6h組顯著下降(P＜0.01)。A549和BEAS-2B細胞的LL-37蛋白水平在SP感染6h、12h后顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，感染15h時表達量較對照組顯著減少（均P

13、＜0.05），且明顯低于6h組(均P＜0.01)。
　　5.SIRT1 siRNA對A549細胞SIRT沉默效果
　　si-SIRT1序列②可顯著降低A549細胞SIRT1 mRNA(P＜0.01)，抑制率為84％，蛋白水平也存在顯著性差異（P＜0.01）。
　　6.SIRT1在SP感染A549和BEAS-2B細胞誘導LL-37和IL-8表達中起負調(diào)節(jié)作用
　　6.1各處理組對A549和BEAS-2B細胞活力的影

14、響
　　與SP組比較，si-SIRT1序列②(75 nmol/L)干擾72h后對A549和BEAS-2B細胞活力有明顯損傷，差異顯著性（均P＜0.01），SRT1720(25umol/L)，DMSO(0.1％)干預對細胞活力無明顯影響(P＞0.05)。
　　6.2 SIRT1負向調(diào)節(jié)SP感染A549和BEAS-2B細胞誘導表達LL-37 mRNA
　　A549和BEAS-2B細胞的SP組SIRT1和LL-37 mRNA

15、表達顯著高于對照組（P＜0.01）。SIRT1 mRNA表達量經(jīng)SRT1720預處理24h后進一步顯著增加（P＜0.01），而LL-37 mRNA表達量下降（P＜0.01）。si-SIRT1沉默SIRT1表達后，LL-37 mRNA表達較SP組顯著升高(P＜0.01)。
　　6.3 SIRT1負向調(diào)節(jié)SP感染A549和BEAS-2B細胞誘導表達LL-37和IL-8蛋白
　　經(jīng)si-SIRT1沉默后，LL-37和IL-8蛋白水

16、平較SP組顯著增高(P＜0.01);激動劑SRT1720則顯著抑制LL-37和IL-8蛋白表達(P＜0.01)，且LL-37蛋白與IL-8蛋白表達量呈顯著正相關(guān)（r=0.831，P＜0.01;r=0.961，P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.SP以MOI和感染時間依賴性方式降低A549和BEAS-2B細胞活性。
　　2.SP感染A549和BEAS-2B細胞可誘導表達LL-37，參與機體免疫防御反應(yīng)。
　　3.