受轉(zhuǎn)化調(diào)控的肺炎鏈球菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因的篩選及其表達(dá)產(chǎn)物定位.pdf

1、目的：
　　 肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，S.pn）是一種常見的革蘭陽性條件致病菌，是引起肺炎、腦膜炎和中耳炎的主要病因。由于S.pn抗生素耐藥率的增加和目前疫苗的缺陷性，使得其感染的后果廣泛而嚴(yán)重，要從根本上解決S.pn的防治問題，就要深入了解其致病的分子機(jī)制。
　　 轉(zhuǎn)化是指細(xì)菌形成感受態(tài)，攝取外源性DNA的過程，細(xì)菌的自然轉(zhuǎn)化是許多重要生理現(xiàn)象的起始和源頭。S.pn自然轉(zhuǎn)化效率最高

2、，大量證據(jù)表明轉(zhuǎn)化可導(dǎo)致細(xì)菌的毒力和耐藥性改變，然而目前人們并不清楚轉(zhuǎn)化如何調(diào)控其毒力。
　　 細(xì)菌進(jìn)入宿主體內(nèi)后必須表達(dá)一些使自身毒力增強(qiáng)或?qū)λ拗鲹p傷加劇的基因，因此細(xì)菌在宿主體內(nèi)表達(dá)的基因往往就是與致病緊密相關(guān)的毒力基因。本課題組前期研究通過體內(nèi)表達(dá)技術(shù)（in vivo expressiontechnology，IVET）和差異熒光誘導(dǎo)技術(shù)（differential nuorescenceinduction，DFI），篩選到

3、了多個(gè)S.pn體內(nèi)誘導(dǎo)基因，其中部分基因功能未知。這些功能未知基因在體內(nèi)表達(dá)增加，與毒力密切相關(guān)。那么這些基因在宿主體內(nèi)是否受轉(zhuǎn)化調(diào)控與S.pn的條件致病相關(guān)呢?我們擬通過構(gòu)建轉(zhuǎn)化缺陷菌，來篩選受轉(zhuǎn)化調(diào)控的S.pn體內(nèi)誘導(dǎo)基因，為深入研究S.pn的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 為進(jìn)一步研究這些基因的功能，我們選擇受轉(zhuǎn)化調(diào)控的基因spd_0873和dnaJ進(jìn)行其表達(dá)產(chǎn)物的定位分析。為判斷亞細(xì)胞組分分離效果，我們選擇一個(gè)已知在細(xì)胞質(zhì)中恒

4、定表達(dá)的蛋白CodY做對照。首先原核表達(dá)重組蛋白，制備多克隆抗體，然后通過western blot和流式細(xì)胞術(shù)分別對這2種蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。
　　 方法：
　　 1.構(gòu)建轉(zhuǎn)化缺陷菌株comE是影響S.pn感受態(tài)形成的關(guān)鍵基因，失活基因comE使細(xì)菌不能發(fā)生轉(zhuǎn)化，因此通過插入失活構(gòu)建的D39comE缺陷菌（D39△comE），即為轉(zhuǎn)化缺陷菌。
　　 2.篩選受轉(zhuǎn)化調(diào)控的肺炎鏈球菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因?qū)39 comE

5、缺陷菌與D39野生菌同時(shí)腹腔注射小鼠后，用RT-PCR分析野生菌和缺陷菌中13個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)基因的mRNA表達(dá)差異，探討這些基因是否受轉(zhuǎn)化調(diào)控。
　　 3.原核表達(dá)Spd_0873、CodY通過構(gòu)建PW28/0873、PW28/codY重組表達(dá)載體，表達(dá)并純化Spd0873、CodY。
　　 4.多克隆抗體的制備利用純化后的Spd0873、CodY蛋白，分別免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠，得到Spd_0873、CodY的

6、多克隆抗體。
　　 5.亞細(xì)胞組分分離及亞細(xì)胞定位分離D39的上清蛋白、細(xì)胞壁、原生質(zhì)體，通過western blot和流式細(xì)胞術(shù)分析Spd_0873、DnaJ（其多克隆抗體己由本實(shí)驗(yàn)室制備）的亞細(xì)胞定位。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過PCR和測序驗(yàn)證，D39 comE缺陷菌株構(gòu)建成功。
　　 2.8個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)基因在缺陷菌株和野生菌株中mRNA表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），其中spd_0300、

7、spd_0414、spd_0622、spd_1663、spd_1719、spd_0235、spd_0873受轉(zhuǎn)化上調(diào)，spd_1672受轉(zhuǎn)化下調(diào)。
　　 3.通過測序和酶切鑒定PW28/0873、PW28/codY重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，表達(dá)并純化得到Spd_0873、CodY。
　　 4.經(jīng)過免疫大白兔和BALB/c小鼠，得到Spd_0873兔多克隆抗體、CodY鼠多克隆抗體。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)分析得出蛋白S

8、pd_0873和DnaJ在S.pn表面均有表達(dá)，western blot鑒定DnaJ在細(xì)胞壁和原生質(zhì)體均有表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.篩選出受轉(zhuǎn)化上調(diào)的體內(nèi)誘導(dǎo)基因spd_0300、spd_0414、spd_0622、spd_1663、spd_1719、spd_0235、spd_0873及下調(diào)的基因spd_1672，它們可能參與生長調(diào)節(jié)、溫度感應(yīng)、糖脂代謝等環(huán)節(jié)，表明細(xì)菌轉(zhuǎn)化可通過調(diào)節(jié)某些體內(nèi)誘導(dǎo)基因的表達(dá)來增強(qiáng)細(xì)菌