肺炎支原體感染對(duì)人肺上皮細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、[目的] 肺炎支原體(MP)是目前所知能在無生命培養(yǎng)基中生長、繁殖的最小原核生物,基因結(jié)構(gòu)十分簡單,喪失了編碼細(xì)胞壁及一些維持生存所必須的基因.這些特征決定了MP特有的寄生方式. MP是一種人類致病原,能引起成人、兒童的社區(qū)獲得性呼吸系統(tǒng)感染,是目前支氣管炎、肺炎的重要病原之一.MP不但引起呼吸系統(tǒng)感染,而且尚與哮喘的發(fā)病密切相關(guān),并可引起廣泛多系統(tǒng)、多器官的肺外并發(fā)癥. 但到目前為止,MP感染的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚,主

2、要傾向于呼吸道上皮細(xì)胞吸附、免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制和MP直接侵入學(xué)說. 近來細(xì)胞因子在MP感染中的作用日益受到重視.現(xiàn)已經(jīng)在MP感染后的支氣管肺泡灌洗液(BAL)、血、肺內(nèi)檢測到IL-2、4、5、6、10、12、18及INF等升高,并有研究表明MP感染人肺上皮細(xì)胞(A549)可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白的變化與細(xì)胞因子的分泌,如IL-1,8,TNF等.其中IL-2,6,8,10,18等與MP所致疾病的嚴(yán)重性相關(guān),IL-4,5可能參與MP引起的過敏性

3、疾病,而:MP有可能通過TGF-β1促進(jìn)膠原蛋白的沉積進(jìn)而共同參與氣道重塑. 盡管:MP吸附于呼吸道上皮細(xì)胞并與上皮細(xì)胞相互作用是感染早期發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié),但目前對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞被MP感染后所發(fā)生的反應(yīng)知之甚少,且目前的研究都是基于對(duì)單一已知蛋白質(zhì)進(jìn)行的分析與鑒定,缺乏整體性與系統(tǒng)性,也無法對(duì)未知蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,因而阻礙了這方面研究的深入. 隨著后基因組時(shí)代的到來,蛋白質(zhì)組學(xué)成為后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域

4、.它是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象,分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系,在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動(dòng)規(guī)律.而2DE技術(shù)與MALDI-TOF-MS技術(shù)是蛋白組學(xué)研究中最經(jīng)典的方法,目前已被廣泛的應(yīng)用于疾病發(fā)病機(jī)制的研究. 本研究首次應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)從整體角度研究呼吸道上皮細(xì)胞受MP感染后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化,比較正常狀態(tài)與受MP感染后A549細(xì)胞蛋白表達(dá)的差異,進(jìn)一步了解呼吸道

5、上皮細(xì)胞在MP感染中的作用、并為闡明:MP感染的發(fā)病機(jī)制提供重要的理論依據(jù). [方法] 本研究采用體外實(shí)驗(yàn)的方法.選用A549細(xì)胞和MP菌株,確定MP的合適濃度.我們用107MP感染106A549細(xì)胞,12小時(shí)后收集細(xì)胞并提取胞內(nèi)蛋白質(zhì),同時(shí)設(shè)立不加MP的對(duì)照組.對(duì)所提蛋白進(jìn)行Bradford法定量后采用17cm,PH4-7的IPG膠條進(jìn)行第一向等電聚焦,12.5﹪的SDS-PAGE進(jìn)行第二向電泳分離,電泳后的凝膠用銀染

6、進(jìn)行染色,并用PDQ[Jest軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖像分析,建立MP處理組和對(duì)照組的胞內(nèi)蛋白質(zhì)差異表達(dá)圖譜.在此基礎(chǔ)上,我們切取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn),然后用特異性的胰酶消化蛋白質(zhì),酶解后的肽段采用Voyager-DE STR MALDI-TOF(ABI)質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析.利用質(zhì)譜分析得到的原始數(shù)據(jù),通過MSCOT搜索NCBInr的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行初步的鑒定. [結(jié)果] 差顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)MP處理組和對(duì)照組細(xì)胞

7、有明顯的形態(tài)學(xué)改變,在雙向電泳圖譜分析中,空白對(duì)照組平均檢測到968個(gè)蛋白點(diǎn),處理組為976個(gè)蛋白點(diǎn).通過PDOIJest軟件分析,MP處理A549細(xì)胞12小時(shí)后A549細(xì)胞內(nèi)未檢測到新的或消失的蛋白點(diǎn),但發(fā)現(xiàn)有二十六個(gè)蛋白點(diǎn)與對(duì)照組比較在量上顯著增加,而有三個(gè)蛋白點(diǎn)明顯降低.利用MALDI-TOF-MS技術(shù)和生物信息學(xué),我們初步鑒定了11個(gè)在MP處理組中升高的蛋白點(diǎn),它們?yōu)榧?xì)胞質(zhì)骨架蛋白波形蛋白、葡萄糖-6磷酸脫氫酶等. [結(jié)