Rac1在神經(jīng)干細(xì)胞遷移中的作用.pdf

1、膠質(zhì)瘤是一種常見的惡性顱內(nèi)腫瘤，因其呈侵染性生長(zhǎng)，使得手術(shù)切除輔以化療、放療的傳統(tǒng)方法往往難以將其根治，死亡率極高。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)前體細(xì)胞，具有無(wú)限自我更新的潛能且能分化為神經(jīng)元，星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。NSCs的遷移能力對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和修復(fù)起到至關(guān)重要的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)NSCs具有向膠質(zhì)瘤定向遷移的能力，使其成為最具潛力的膠質(zhì)瘤靶向基因治療載體之一。Rac1是Rh

2、o家族小G蛋白成員之一，它通過(guò)活性的GTP結(jié)合形式和非活性的GDP結(jié)合形式間的轉(zhuǎn)化，調(diào)控板狀偽足的產(chǎn)生和膜褶皺樣運(yùn)動(dòng)等多種細(xì)胞生理過(guò)程，被認(rèn)為是細(xì)胞遷移重要的調(diào)控分子之一。為了更加正確有效的利用NSCs作為膠質(zhì)瘤基因治療的載體，膠質(zhì)瘤趨化NSCs定向遷移的潛在調(diào)控機(jī)制亟需被闡明。目前的研究多集中于膠質(zhì)瘤產(chǎn)生的細(xì)胞因子或細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)誘導(dǎo)NSCs定向遷移的作用，而NSCs應(yīng)答外來(lái)信號(hào)并調(diào)控自身遷移變化的細(xì)胞內(nèi)部分子機(jī)制的研究還很少。

3、 在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先提取了本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的總RNA，通過(guò)RT—PCR的方法克隆得到了大鼠的Rac1（NCBI Accesssion number：NM_134366） cDNA，將其TA克隆至pMD19—T載體上。DNA測(cè)序鑒定正確的重組載體命名為pMD19—T—Rac1，質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組載體，以之為模板使用Quik—Change定點(diǎn)突變技術(shù)快速構(gòu)建Rac1組成型激活突變體Rac1—Q61L、Rac1—G12

4、V、和Rac1顯性陰性突變體Rac1—T17N。DNA測(cè)序鑒定的上述三突變體，測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆分別命名為pMD19—T—Rac1Q61L、pMD19—T—Rac1G12V、pMD19—T—Rac1T17N。使用 SalⅠ， XhoⅠ雙酶切pMD19—T—Rac1、pMD19—T—Rac1G12V、pMD19—T—Rac1T17N，膠回收約580 bp的目的小片段。上述同樣的酶雙酶切IRES真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP，膠回收載體

5、大片段。T4連接酶16℃過(guò)夜連接上述回收的大小片段，轉(zhuǎn)化E coli． TOP10菌，隨機(jī)挑取克隆DNA測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的重組載體分別命名為pIRES2-EGFP—Rac1、pIRES2-EGFP—Rac1G12V、pIRES2-EGFP—Rac1T17N。 同時(shí)我們使用Invitrogen公司的RNA干擾（RNAi）在線設(shè)計(jì)工具：BLOCK—iTTMRNAi Designer針對(duì)大鼠Rac1基因設(shè)計(jì)優(yōu)選三對(duì)干擾序列，送公司合

6、成單鏈寡核苷酸片段后退火定向克隆至RNAi表達(dá)載體pcDNA6．2-GW/EmGFP—miR中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞挑取單克隆，DNA測(cè)序鑒定。鑒定正確的重組載體分別命名為pcDNA6．2-GW/EmGFP—miR1、2、3。 最后抽提上述構(gòu)建的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP—Rac1，pcDNA6．2-GW/EmGFP—miR2脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染C17．2神經(jīng)干細(xì)胞系，分別用于上調(diào)和下調(diào)C17．2細(xì)胞中Rac1的表達(dá)水平。抽提載體pI

7、RES2-EGFP—Rac1G12V，pIRES2-EGFP—Rac1T17N轉(zhuǎn)染C17．2神經(jīng)干細(xì)胞系，以改變C17．2細(xì)胞中Rac1的活性狀態(tài)。其中Rac1G12V能夠持續(xù)保持GTP結(jié)合的激活狀態(tài)，Rac1T17N能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制GEF對(duì)Rac1的作用，從而阻斷Rac1活性。 轉(zhuǎn)染24-48 h內(nèi)，使用Leica DMI6000B活細(xì)胞工作站活細(xì)胞拍攝。使用ImageJ軟件及其插件Manual Tracking分別對(duì)GFP陽(yáng)性

8、和GFP陰性的細(xì)胞進(jìn)行遷移行為的統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，分別上調(diào)和下調(diào)Rac1的表達(dá)水平并不能顯著改變C17．2細(xì)胞的遷移平均速率及遷移效率。而轉(zhuǎn)染了組成型激活突變體的實(shí)驗(yàn)組與其對(duì)照相比則能顯著提升C17．2的遷移平均速率，轉(zhuǎn)染顯性陰性突變體的實(shí)驗(yàn)組與其對(duì)照相比C17．2細(xì)胞的遷移平均速率顯著下降，然而兩者的FMI與對(duì)照組相比仍無(wú)顯著變化。 以上結(jié)果說(shuō)明Rac1—GTP才是Rac1調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的活性形式，僅僅上調(diào)或下調(diào)Rac1的

9、表達(dá)水平并不足以顯著改變C17．2神經(jīng)干細(xì)胞系的平均遷移速率，而通過(guò)改變C17．2細(xì)胞內(nèi)Rac1的活性狀態(tài)則能顯著改變C17．2神經(jīng)干細(xì)胞系的平均遷移速率。此外，F(xiàn)MI是細(xì)胞定向遷移水平的指標(biāo)，在無(wú)外在誘導(dǎo)物刺激的情況下，無(wú)論改變Rac1表達(dá)水平或活性狀態(tài)均不能顯著改變C17．2細(xì)胞遷移的效率。上述結(jié)論初步揭示了Rac1在NSCs遷移中的作用，為進(jìn)一步研究Rac1在膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基或其他趨化因子、生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)NSCs定向遷移的中的作用建