Rac1 GTP酶的活化對白血病細(xì)胞在骨髓微環(huán)境中的滯留及其在干性維持中的作用.pdf

1、目的：研究Rac1GTP酶的活化對白血病細(xì)胞抵抗藥物殺傷、周期、和歸巢等干性特征的影響。
　　 方法：用構(gòu)建的Rac1組成活化型慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-Rac1-V12、Rac1負(fù)顯性抑制型慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-Rac1-N17以及慢病毒空載體pCDH-MCS1-EF1-copGFP分別轉(zhuǎn)染KG1a細(xì)胞；流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測VP16對三種KG1a處理24h和48h后的細(xì)

2、胞凋亡情況；流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測三種KG1a細(xì)胞的G0期細(xì)胞比例的差異；流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測用Rac1特異性抑制劑NSC23766對KG1a細(xì)胞處理4天后，細(xì)胞G0期比例的變化；將三種KG1a細(xì)胞分別尾靜脈注射到亞致死劑量照射過的NOD/SCID小鼠體內(nèi)，16h后用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測骨髓中三種細(xì)胞的歸巢能力；對小鼠的骨髓切片進(jìn)行免疫組化染色，以觀察白血病細(xì)胞在骨髓中的定位情況；實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測G0期相關(guān)基因的mRNA在三種KG1a細(xì)胞

3、中的表達(dá)差異；免疫熒光共聚焦技術(shù)觀察相關(guān)分子在細(xì)胞中的表達(dá)；將三種KG1a細(xì)胞分別與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測細(xì)胞G0期比例。
　　 結(jié)果：在VP16處理細(xì)胞24h和48h后，感染Rac1負(fù)顯性抑制型慢病毒載體的KG1a細(xì)胞(Rac1-N17-KG1a)早期凋亡和晚期凋亡的比例顯著高于感染Rac1組成活化型慢病毒載體的KG1a細(xì)胞(Rac1-V12-KG1a)(P＜0.05);Rac1-V12-KG1a細(xì)胞的G0期細(xì)胞比例最高，而Ra

4、c1-N17-KG1a細(xì)胞的G0期比例最低，三者的G0期比例相比具有顯著性差異(P＜0.05);Rac0特異性抑制劑處理的KG0a細(xì)胞隨著抑制劑濃度的增加，G0細(xì)胞比例顯著下降(P＜0.05);Rac1-V12-KG1a細(xì)胞的歸巢能力要顯著高于Rac1-N17-KG1a細(xì)胞(P＜0.05)；通過免疫組化染色觀察到KG1a細(xì)胞主要定位在成骨細(xì)胞區(qū)；通過實(shí)時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，N-Cadherin、Tie-2和c-MPL三種基因的mRNA表

5、達(dá)水平在Rac1-V12-KG1a細(xì)胞中顯著高于Rac1-N17-KG1a細(xì)胞(P＜0.05)，免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察確定三種分子的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)趨勢一致；與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)后G0期細(xì)胞比例趨勢與未共培養(yǎng)的相一致，三組細(xì)胞G0期細(xì)胞比例均有明顯上升(P＜0.05)，
　　 結(jié)論：Rac1GTP酶的活化能夠通過上調(diào)N-Cadherin、Tie-2和c-MPL三種基因的表達(dá)，提高白血病細(xì)胞在骨髓中的歸巢能力，增加休眠期細(xì)胞的