PINCH-1表達(dá)異常及其干預(yù)對白血病骨髓造血微環(huán)境的影響.pdf

1、目的：
　　 PINCH-1(Particulary Interesting New Cysteine- Histicline rich protein)蛋白是一種新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)基質(zhì)以及粘附分子密切相關(guān)的蛋白，由5個(gè)LIM(含有Lin-11, Isl-1and Mec-3蛋白的結(jié)構(gòu)域)結(jié)構(gòu)以及一個(gè)C′端構(gòu)成。目前國內(nèi)外關(guān)于PINCH-1在白血病骨髓造血微環(huán)境中的表達(dá)及其作用方面的研究尚未見報(bào)道。本課題擬從此角度入手，探討P

2、INCH-1蛋白在白血病骨髓基質(zhì)的表達(dá)水平與分布情況，并通過特異性阻斷PINCH-1的表達(dá)后，觀察拮抗PINCH-1表達(dá)后Bim,ILK等相關(guān)蛋白表達(dá)的變化情況，同時(shí)觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的變化情況。本實(shí)驗(yàn)通過上述的綜合研究，探討PINCH-1在白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的變化及其與白血病細(xì)胞相互作用的可能改變，為探索從新的角度治療白血病提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1.白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞PINCH-1的表達(dá)與分布<

3、br>　　 收集15例急性髓細(xì)胞白血病患者、17例急性淋巴細(xì)胞白血病患者(均為初發(fā)白血病患者)和30例正常對照的骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
　　 (1)培養(yǎng)正常和急性白血病患者的骨髓基質(zhì)細(xì)胞；
　　 (2)應(yīng)用RT-PCR法，檢測正常和急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞中PINCH-1的mRNA表達(dá)；
　　 (3)Western blot法檢測PINCH-1蛋白在正常和急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，免疫熒光和免疫組織化學(xué)檢測PINC

4、H-1在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的分布。
　　 2. RNAi阻抑骨髓基質(zhì)細(xì)胞PINCH-1的表達(dá)
　　 收集初發(fā)急性白血病患者(急淋4例、急非淋2例)骨髓標(biāo)本6例。
　　 (1)培養(yǎng)急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞；
　　 (2)構(gòu)建以針對PINCH-1的慢病毒為載體的RNA干擾片段；
　　 (3)以慢病毒為載體RNAi沉默PINCH-1的表達(dá)；
　　 (4)RT-PCR檢測RNAi干預(yù)骨髓基質(zhì)細(xì)胞前后急性

5、白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞PINCH-1mRNA表達(dá)的變化；
　　 (5)Western blot法檢測RNAi沉默PINCH-1前后急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞PINCH-1、Bim、ILK蛋白表達(dá)的變化；
　　 (6)MTT法檢測RNAi沉默PINCH-1前后急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖情況的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞PINCH-1表達(dá)明顯高于正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞：在急性淋巴細(xì)胞白血病和急性

6、非淋巴細(xì)胞白血病患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞中，PINCH-1在mRNA水毛和蛋白水平均比正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞增高((P<0.01)；急性淋巴白血病PINCH-1蛋白的表達(dá)明顯高于急性非淋巴細(xì)胞白血病(P<0.01)，但mRNA表達(dá)無明顯差別；
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光顯示，在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中PINCH-1蛋白主要在細(xì)胞漿表達(dá)，細(xì)胞核則未見明顯表達(dá)；
　　 3.成功構(gòu)建慢病毒為載體的RNA干擾片段；
　　 4.以慢病毒為載

7、體RNAi沉默了骨髓基質(zhì)細(xì)胞中PINCH-1的表達(dá)，沉默后：(1)PINCH-1的表達(dá)在RNA和蛋白水平均明顯降低；(2)BIM蛋白表達(dá)升高；(3)ILK蛋白則表達(dá)降低；(4)阻抑后白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖活性明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞存在PINCH-1的高表達(dá)；
　　 2.PINCH-1可能通過與ILK形成的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)參與了白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞的粘附功能的調(diào)節(jié)；
　　 3.PINC