ALA-PDT對白血病細胞及耐藥細胞的干預及機制研究.pdf

1、目的：
　　 急性白血病是威脅人類健康的常見血液腫瘤之一。目前化療仍是治療急性白血病的主要手段，而白血病細胞對于化療藥物產(chǎn)生耐藥性則是化療失敗和臨床復發(fā)的主要原因。干細胞移植是治療白血病的另一個主要手段，然而移植物中殘存的耐藥腫瘤細胞往往導致自體移植失敗或緩解后復發(fā)。因此探索新的克服、逆轉(zhuǎn)耐藥的方法非常重要。
　　 5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)介導的光動力治療(photody

2、namic therapy，PDT)是一種較新型的腫瘤治療手段，利用腫瘤細胞對ALA產(chǎn)生的內(nèi)源性光敏劑原卟啉Ⅸ(PpⅨ)的優(yōu)先攝取，使腫瘤細胞在受到一定的光照后被選擇性地殺傷?；诠鈩恿Ο煼ǖ膬艋夹g(shù)較其他凈化方法的優(yōu)勢在于對腫瘤細胞的選擇性殺傷，以最大程度地減少對正常前體細胞及干細胞的損傷。因此ALA-PDT在白血病自體移植物體外凈化中具有潛在的應(yīng)用價值。已有研究顯示ALA-PDT在白血病細胞中具有誘導凋亡作用，但到目前為止，ALA-

3、PDT引起腫瘤細胞破壞的確切機制尚未完全闡明。在白血病耐藥中的研究尚鮮見報道。
　　 本課題通過對ALA-PDT致白血病細胞及耐藥株凋亡的研究，將有助于深入了解ALA-PDT對白血病細胞增殖、凋亡及其信號傳導途徑的調(diào)控，較全面的闡述ALA-PDT在白血病及耐藥中的潛在應(yīng)用價值，將為ALA-PDT這一新的治療手段最終應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.利用生長曲線、MTT法測定細胞增殖，對ALA的濃度

4、、孵育時間及光的能量密度等有關(guān)ALA-PDT實驗條件選擇方面進行初步探討。
　　 2.利用MTT法檢測ALA-PDT對HL-60及其耐藥株HL-60/ADR細胞增殖的影響；應(yīng)用瑞氏染色光學顯微鏡和透射電鏡觀察細胞形態(tài)，采用磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)+碘化丙錠(PI)雙染法通過流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞的比例，并用共聚焦激光顯微鏡觀察凋亡細胞形態(tài)。
　　 3.采用陽離子脂質(zhì)熒光探針JC-1(5,5',6,6'-tetr

5、achloro-1,1',3,3'-tetraethyl-benzimidazol-carbocyanine iodide，四氯四乙基苯并咪唑羰花青)檢測ALA-PDT前后兩種細胞株線粒體跨膜電位的變化。
　　 4.半定量逆轉(zhuǎn)錄酶-多聚酶鏈式反應(yīng)及Real time PCR檢測ALA-PDT對兩種細胞株Bcl-2 mRNA表達的調(diào)控，同時還檢測了ALA-PDT對HL-60/ADR細胞株中耐藥相關(guān)基因MRP mRNA表達的調(diào)控。<

6、br>　　 5.利用基因芯片技術(shù)，從全基因組水平研究ALA-PDT對HL-60及HL-60/ADR細胞基因表達譜變化，探討ALA-PDT對兩種細胞可能的作用機制。
　　 6.利用MTT法檢測細胞增殖研究ALA-PDT在原代白血病細胞及正常單個核細胞(MNC)中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.觀察ALA-PDT對HL-60及HL-60/ADR細胞株增殖的影響中最適實驗條件為：ALA濃度1mM、避光孵育4h后，以

7、波長630nm、能量密度為18J/cm2的光照射。
　　 2.ALA-PDT對兩種細胞增殖和凋亡的影響：ALA-PDT后兩種細胞株增殖均受到抑制，48h較24h更明顯。常規(guī)應(yīng)用瑞氏染色光鏡及透射電鏡觀察細胞形態(tài)，兩種細胞均發(fā)生了核固縮、凋亡小體等典型的凋亡改變；采用AnnexinV檢測凋亡細胞比例隨時間延長而隨之增加，HL-60細胞在ALA-PDT后4h凋亡細胞比例與對照組比較有顯著差異(P值＜0.05)；而HL-60/ADR細

8、胞在3h凋亡細胞比例與對照組比較有顯著差異(P值＜0.05)；在兩種細胞株間比較，僅在4h時HL-60細胞凋亡率顯著高于HL-60/ADR細胞(P值＜0.05)，而3h、24h比較兩種細胞株無顯著差異。在AnnexinV/FITC-PI染色后激光共聚集顯微鏡觀察到了典型的早期凋亡和晚期凋亡形態(tài)。兩種細胞株的單純ALA組、單純光照組與對照組比凋亡細胞比例均無顯著差異(P值＞0.05)。
　　 3.陽離子脂質(zhì)熒光探針JC-1顯示：A

9、LA-PDT后HL-60和HL-60/ADR兩種細胞株線粒體跨膜電位崩塌的細胞比例明顯升高，光照結(jié)束即刻(0h)分別升高至58.28％±0.92％和55.91％±2.60％，隨時間延長，這種細胞比例逐步增多，呈一定的時間依賴性。顯示線粒體跨膜電位下降的發(fā)生早于形態(tài)學改變，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面。
　　 4.RT-PCR及Real time PCR均顯示：ALA-PDT能下調(diào)HL-60及HL-60/ADR細胞Bcl-2基

10、因的表達，而HL-60/ADR細胞耐藥相關(guān)基因MRP也有明顯下調(diào)。
　　 5.Illumina人全基因組芯片共檢測了48，000個基因，用RT-PCR的方法驗證了數(shù)據(jù)的可靠性，對芯片結(jié)果產(chǎn)生的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：ALA-PDT影響了細胞的多種生命進程，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控，抑制翻譯過程；促進一系列應(yīng)激反應(yīng)；上調(diào)促凋亡基因的表達，抑制抗凋亡基因的表達，促進凋亡的發(fā)生。
　　 6.正常骨髓MNC的ALA+PDT組在接受18J/cm2的光照劑

11、量時細胞生長無明顯抑制。臍血MNC的ALA+PDT組在接受18～54J/cm2的光照劑量下，細胞存活率與對照組比較無顯著差異。ALA-PDT對急性白血病原代細胞顯示有不同程度的殺傷，初發(fā)和復發(fā)難治組光動力效應(yīng)分別為53.40％±13.33％和62.42％±39.66％(24h)，64.11％±17.71％和68.78％±30.30％(48h)，初發(fā)和復發(fā)難治組比較無顯著差異。
　　 小結(jié)：
　　 1.ALA介導的PDT能

12、誘導白血病細胞株HL-60及其耐藥株HL-60/ADR凋亡，呈一定的時間依賴性。
　　 2.ALA介導的PDT誘導的細胞凋亡可改變線粒體膜電位，下調(diào)Bcl2基因表達，膜電位的改變早于細胞形態(tài)和磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面，提示凋亡與線粒體的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。
　　 3.ALA-PDT介導的HL-60/ADR細胞中耐藥基因CIAPIN1、MRP、Bcl2基因的下調(diào)，可能是ALA-PDT能逆轉(zhuǎn)/克服耐藥的因素之一。多藥耐藥細胞株

13、HL-60/ADR與ALA-PDT無交叉耐藥。
　　 4.多種調(diào)控機制參與凋亡的發(fā)生：HL-60/ADR細胞中線粒體途徑和Fas途徑的激活，主要是DEDD2及CDC2L2介導的凋亡通路占主要地位，其中FLASH、Bcl2、PAK1、E1B19K等基因參與其中促進凋亡的發(fā)生。HL-60細胞中c-Abl、PML、C-MYC基因是上調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)中的主導基因，共同參與了凋亡的發(fā)生。線粒體途徑和TNF途徑激活，DEDD2及CDC2L2介導的