RNA干擾對白血病細胞WT1基因表達及細胞增殖的影響.pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)又稱基因沉默是一種序列特異性的轉錄后基因沉默機制。它通過一段雙鏈RNA(dsRNA)導致同源mRNA降解，從而使目的基因表達下調，是生物體內的一種進化保守機制。相關研究已證明21bp的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)能夠在哺乳動物細胞內誘導RNAi效應。通過制備特定的siRNA，導入生物體內可以有目的地抑制靶基因的表達，因此RNAi可用于基因功能分析

2、、治療病毒感染、治療腫瘤以及其它基因相關性疾病方面的研究。在白血病中，研究者使用針對BCR-ABL的siRNA可有效地抑制BCR-ABL在白血病細胞中的表達，并導致細胞凋亡。 Wilms'瘤基因(Wilms'tumorgene,WT1)最初被認為是腫瘤抑制基因，但在人類白血病細胞中呈異常高表達，其表達水平與預后呈負相關。WT1基因的反義寡核苷酸可抑制白血病細胞增殖、誘導細胞凋亡。該基因在發(fā)育分化和白血病生成中起重要作用。

3、 本研究采用WT1siRNA抑制WT1基因在K562細胞株中的表達，觀察抑制K562細胞中WT1基因對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響，從而探討癌基因WT1在白血病中作為腫瘤基因治療靶位以及WT1基因相關藥物開發(fā)的可能性，為白血病的基因治療提供新的思路。 材料與方法 訂購化學合成3條WT1siRNAs，同時將K562細胞置于10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3d更換培養(yǎng)液、按

4、1∶3傳代。取指數(shù)增長期細胞，在轉染實驗開始前12h更換新鮮無抗生素培養(yǎng)液。 實驗分兩步： (1)使用GADPHsiRNA優(yōu)化轉染條件。設3個濃度組，分別為10nM/孔試驗組、20nM/孔試驗組和30nM/孔試驗組。每次試驗設兩個對照組，即陰性對照組(陰性對照siRNA)和空白對照組。使用細胞存活率檢測和RT-PCR結果來尋找最合適的轉染濃度。 (2)以最佳轉染濃度將3組WT1-siRNAs導入細胞，每次試驗設兩

5、個對照組，即陰性對照組(陰性對照siRNA)和空白對照組。與對照組比，使用RT-PCR測定3組WTlsiRNA介導的WTlmRNA的抑制。除了檢測WTlmRNA的表達水平，使用形態(tài)學觀察、MTT和流式細胞學評估細胞增殖和凋亡情況。 結果 (1)以不同濃度GADPHsiRNA處理細胞后，各濃度轉染組的細胞生存率和GADPHmRNA表達下調程度均不同。隨著轉染濃度的增加，細胞生存率逐漸增高。但最高的轉染濃度(30nM/孔)在

6、轉染后不超過6小時就導致了細胞死亡的出現(xiàn)。與對照組無明顯改變相比，20nM/孔的試驗組GADPHmRNA表達的下調最為明顯。使用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在20nM/孔試驗組GADPHmRNA表達下降60～80％。 (2)以最佳轉染濃度(20nM/孔)轉染W(wǎng)TlsiRNA。轉染后48小時，WTlsiRNA3能顯著減少GAPDHmRNA水平70～80％。使用瑞吉氏染色，可以看到典型的凋亡形態(tài)學改變。MTT結果示W(wǎng)TlsiRNA能抑制K5

7、62細胞增殖。流式細胞學檢測到導入WTlsiRNA48小時后細胞發(fā)生凋亡。這些結果表明了與對照組相比，化學合成的WTlsiRNA在K562細胞中能顯著地抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡。 結論 1本研究證實了WTl基因在白血病中的癌基因的功能。化學合成WTlsiRNA在體外能夠通過降低WTlmRNA的表達水平，有效抑制白血病細胞增殖并適度提高其凋亡率，預示siRNA介導的RNAi在基因異常激活和過度表達性疾病以及抗腫瘤的基因治

8、療方面具有應用的前景。雖然盡管WTlsiRNA能有效地抑制WTl表達，但并不能完全地沉默靶基因。 2通過WTlsiRNA各試驗組對細胞增殖及凋亡影響效果的不同，提示W(wǎng)Tl基因可能在導致和影響腫瘤形成的網(wǎng)絡機制中起一定的作用，這一作用可使得腫瘤治療能起到一個網(wǎng)絡連鎖反應，從而提高腫瘤治療的效果。 3本研究發(fā)現(xiàn)RNAi效應具有濃度和時間依賴性。即對siRNA的量有一定的依賴性，一定范圍內，隨著siRNA增高，RNAi效果增強