干擾CD147表達(dá)對(duì)白血病SHi-1細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的和意義：
　　 研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(Extracellular matrixmetalloproteinase inducer，Emmprin，CD147)在乳腺癌、肝癌、喉鱗癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高度表達(dá)，而且與腫瘤的惡性程度相關(guān)，但與白血病浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移關(guān)系目前并未有明確研究。本研究通過(guò)慢病毒干擾載體干擾人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株SHI-1細(xì)胞的CD147表達(dá)，建立SHI-1細(xì)胞與急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞(

2、bone marrow stromal cells，BMSCs)體外共培養(yǎng)模型，觀察干擾CD147表達(dá)后SHI-1細(xì)胞體外增殖、侵襲能力的影響，并通過(guò)裸鼠白血病模型，進(jìn)一步明確CD147在白血病浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 方法：
　　 1、參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，針對(duì)CD147的RNAi靶點(diǎn)序列，合成靶序列Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的pGCSIL-GFP載體連接產(chǎn)生RNA慢病毒載體pG

3、C-LV，PCR鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序，測(cè)序正確的pGC-LV/CD147、pHelper1.0和pHelper2.0質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體2000，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得重組慢病毒，用逐孔稀釋法測(cè)定病毒滴度，同理針對(duì)CD147陰性干擾序列，構(gòu)建陰性病毒，測(cè)定病毒滴度。
　　 2、病毒構(gòu)建成功后，用PGC-LV/CD147慢病毒及陰性對(duì)照病毒感染SHI-1細(xì)胞，分別命名為SHI-1/CD147及SHI-1/NC細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為SHI-1、SH

4、I-1/CD147及SHI-1/NC三組，感染后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(FCM)細(xì)胞中GFP熒光率。用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中CD147、MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中CD147蛋白的表達(dá)。成功干擾SHI-1細(xì)胞CD147表達(dá)后，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞體外增殖能力。
　　 3、收集急性非淋巴細(xì)胞白血病患者骨髓，培養(yǎng)BMSCs，按1:10比例將BMSCs與SHI-1細(xì)胞混合接種于鋪有Mat

5、rigel基質(zhì)膠的Millicell小室中，共培養(yǎng)24h后，將下層液體混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)跨Matrigel膠移行至小室下層的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算移行細(xì)胞比例。
　　 4、裸鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：①皮下成瘤：購(gòu)買6周齡BALB/c裸鼠，不進(jìn)行任何處理。裸鼠給予左前肢皮下注射5×106/只SHI-1、SHI/NC、SHI-1/CD147三組細(xì)胞，每組6只，觀察皮下腫瘤大小，測(cè)量腫瘤體積和腫瘤重量并對(duì)腫瘤進(jìn)行HE染色及免疫組化檢測(cè)皮下腫瘤CD14

6、7蛋白的表達(dá)。②經(jīng)尾靜脈接：6周齡BALB/c裸鼠進(jìn)行切牌(splenectony)，環(huán)磷酰胺腹腔注射(cytoxan intraperitoneal injection)及全身亞致死劑量輻照(sublethal irradiation)等預(yù)處理(SCI預(yù)處理)，經(jīng)尾靜脈接種1×107個(gè)SHI-1、SHI-1/NC、SHI-1/CD147細(xì)胞，每組8只，觀察裸鼠生存期，在裸鼠瀕死前或死亡后立即解剖，觀察各臟器腫瘤生長(zhǎng)情況，取肝、肺、腎等

7、組織于10％的中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，采用抗人CD45抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色反應(yīng)，觀察白血病細(xì)胞在臟器中浸潤(rùn)分布情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、通過(guò)逐孔稀釋法，成功構(gòu)建了可供轉(zhuǎn)染的且?guī)в蠫FP綠色熒光的慢病毒，測(cè)得陽(yáng)性病毒滴度為1×109TU/ml，陰性病毒滴度為2×109TU/ml。
　　 2、FCM檢測(cè)SHI-1/CD147GFP熒光率為94％、SHI-1/NC為82％，WesternB

8、lot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SHI-1/CD147細(xì)胞的CD147蛋白較SHI-1/NC下將91％，SHI-1/NC與SHI-1細(xì)胞之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SHI-1/CD147細(xì)胞CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA表達(dá)比SHI-1/NC細(xì)胞分別下降83％、72％及63％，而SHI-1/NC與SHI-1細(xì)胞之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。成功干擾SHI-1細(xì)胞CD147表達(dá)后，MTT發(fā)現(xiàn)SHI-1/CD147組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的OD值顯著低于

9、SHI-1組及SHI-1/NC組細(xì)胞(均p<0.05)。
　　 3、單獨(dú)SHI-1細(xì)胞不能跨Matrigel基質(zhì)膠向Millicell下層移行，與BMSCs共培養(yǎng)后，SHI-1細(xì)胞及SHI-1/NC細(xì)胞跨Matrigel基質(zhì)膠向下層移行能力顯著提高，24h后移行至下層的細(xì)胞占接種細(xì)胞數(shù)的比例分別為SHI-1+BMSCs：18.2±2.5％(15％～21％)；SHI-1/NC+BMSCs：16.5±2.7％(13.5％～19.5％

10、)；SHI-1細(xì)胞組和SHI-1/NC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而SHI-1/CD147+BMSCs：4.5±1.2％(3％～6％)，侵襲比例明顯下降，與SHI-1組和SHI-1/NC組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　 4、裸鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：①皮下成瘤發(fā)現(xiàn)：SHI-1/CD147細(xì)胞在裸鼠皮下形成的腫瘤重量和體積顯著低于SHI-1及SHI-1/NC細(xì)胞在裸鼠皮下形成的腫瘤(p<0.05)。免疫組化顯示SHI-1/CD

11、147瘤體中CD147表達(dá)低于SHI-1及SHI-1/NC腫瘤。②經(jīng)尾靜脈接種：接種SHI-1的裸鼠中位生存期為32天(22-33天)，接種SHI-1/NC細(xì)胞的裸鼠中位生存期為28天(26-30天)，而接種SHI-1/CD147細(xì)胞的裸鼠生存期明顯延長(zhǎng)，中位生存期為41天(24-47天)，SHI-1/CD147組裸鼠生存期與SHI-1組和SHI-1/NC組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，尸體解剖顯示接種SHI-1、SHI-1/NC

12、細(xì)胞的裸鼠肝臟、腎臟、肺、胃、睪丸可見腫瘤生長(zhǎng)，而接種SHI-1/CD147細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)臟器浸潤(rùn)能力下降，HE染色、人CD45免疫組化染色在裸鼠的肝臟、腎臟、肺、胃、睪丸均發(fā)現(xiàn)SHI-1細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)我們成功構(gòu)建的慢病載體，通過(guò)感染SHI-1細(xì)胞，可對(duì)其生物學(xué)行為做進(jìn)一步研究。
　　 (2)SHI-1/CD147細(xì)胞的體外增殖及侵襲能力明顯下降，且通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-

13、9 mRNA表達(dá)下降，這可能與干擾CD147表達(dá)后，不能刺激SHI-1細(xì)胞分泌MMPs有關(guān)。
　　 (3)在白血病患者BMSCs與白血病SHI-1細(xì)胞接觸時(shí)，SHI-1細(xì)胞跨Matrigel基質(zhì)膠能力提高，干擾CD147表達(dá)后，其侵襲能力下降，可能是BMSCs與SHI-1細(xì)胞通過(guò)CD147來(lái)誘導(dǎo)SHI-1細(xì)胞提高跨Matrigel侵襲能力，這也可能是白血病細(xì)胞向髓外浸潤(rùn)的主要機(jī)制之一。
　　 (4)皮下成瘤結(jié)果表明，干擾

14、CD147表達(dá)后，體外成瘤能力下降，免疫組化顯示SHI-1/CD147腫瘤組織中CD147表達(dá)低于SHI-1及SHI-1/NC腫瘤。尾靜脈結(jié)果表明，干擾CD147表達(dá)后，裸鼠生存期明顯延長(zhǎng)，且在臟器中的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力下降，進(jìn)一步證實(shí)CD147可能誘導(dǎo)MMPs，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。
　　 綜上所述：本文通過(guò)構(gòu)建慢病毒載體干擾CD147的表達(dá)，進(jìn)行多器官浸潤(rùn)以及體外白血病SHI-1細(xì)胞和BMSCs共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)干擾CD147的表